凋亡檢測(cè)操作流程
 
一、Annexin V 檢測(cè)凋亡細(xì)胞膜的改變
 
試劑及溶液：
 
A．對(duì)于單獨(dú)購(gòu)買的試劑：
 
a) 10X Binding Buffer （貨號(hào)：556454）：0.1 M HEPES，pH 7.4；1.4 M NaCl；25 mM CaCl 2。使用前稀
釋至 1X。
 
b) Propidium Iodide（PI，貨號(hào)：556463）：建議與以下試劑同時(shí)使用 Annexin V-FITC（貨號(hào)： 556420,
556419）或 Annexin V-Biotin （貨號(hào)： 556418，556417）
 
c) Via-Probe™ （貨號(hào)：555816 ）：核酸染料 7-AAD。建議與以下試劑同時(shí)使用 Annexin V-PE（貨號(hào)：
556422，556421）或 Annexin V-Biotin（貨號(hào)：556418，556417）。
 
d) 1X PBS Buffer （貨號(hào)： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 · 7H20, 0.24 g KH2PO4 , 加水至
1L。調(diào)整 pH 值至 7.2。 高壓滅菌室溫保存。
 
B．對(duì)于凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：556547）
 
a)  FITC Annexin V （組分編號(hào)： 51-65874X）：每個(gè)樣本 5 μl 用量。
 
b)  Propidium Iodide （PI，組分編號(hào)： 51-66211E)）：現(xiàn)成的核酸染料。每個(gè)樣本 5 μl 用量。
 
c)  10X Annexin V Binding Buffer（組分編號(hào)： 51-66121E）： 0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl,
25 mM CaCl2.使用時(shí)用雙蒸水配制成 1X。
 
操作步驟：
 
1．取 Falcon 試管，按標(biāo)本順序編好陰性對(duì)照管和標(biāo)本管號(hào)。
 
2．使用冷的 PBS 緩沖液洗細(xì)胞兩次，再用 1´ Binding Buffer 緩沖液制成 1´106 細(xì)胞/ml 的懸液。
 
3． Falcon 試管中加入 100 µl 細(xì)胞懸液。
 
4．按以下體積加入 Annexin V 與核酸染料：
 
管號(hào)          名稱            熒光標(biāo)記 Annexin V            核酸染料：
1           陰性對(duì)照                 -                         -
2            單陽(yáng) 1               AV-FITC                      -

3            單陽(yáng) 2                  -                         PI
4            樣本                 AV-FITC                      PI

5．輕輕混勻，室溫（20°C ~25°C）避光處放置 15 分鐘。
 
6． *使用 Annexin V-Biotin 試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：
 
h  1´Binding Buffer緩沖液洗細(xì)胞一次，去上清。
 
h  1´Binding Buffer緩沖液100µl溶解SAv-FITC試劑0.5µg，加入到細(xì)胞管中。
 
h 輕輕混勻。加入5µl PI，室溫（20-25°C）避光處放置15分鐘。
 
7．各試驗(yàn)管中分別加入 1´Binding Buffer 緩沖液 400µl。1 小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。

Annexin V Blocking 
 
待測(cè)細(xì)胞與未標(biāo)記的重組 Annexin V 預(yù)孵育，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是 Annexin V 細(xì)胞凋亡檢測(cè)的質(zhì)量控制。
原理是預(yù)先阻斷 Annexin V-FITC 的結(jié)合位點(diǎn)，這樣可以證明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特異性。
 
1.  使用冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞兩次，再用1´Binding Buffer緩沖液制成1´106細(xì)胞/ml的懸液。
 
2.  在5ml的培養(yǎng)管中加入100µl細(xì)胞懸液（約1´105個(gè)細(xì)胞）。
 
3.  加入5-15µg純化的重組Annexin V。注意，不同的細(xì)胞系，以及凋亡的不同階段，其Annexin V位點(diǎn)
飽和所需要的純化的重組Annexin V含量不同。某些情況下，為達(dá)到效果，可以減少細(xì)胞數(shù)量，
0.5´105個(gè)細(xì)胞加5-15µg純化的重組Annexin V。
 
4.  輕輕混勻，室溫反應(yīng)15分鐘。
 
5.  加入5µl的Annexin V-FITC或/和PI，輕輕混勻，室溫避光處放置15分鐘。
 
6.  各試驗(yàn)管中分別加入1´Binding Buffer緩沖液400µl。
 
7.  1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。