定型內(nèi)胚層分化血清替代品

僅用于科學研究

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：定型內(nèi)胚層分化血清替代品（5×）

貨號：RC200127

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

-80 ℃保存。避免反復凍融，在所需要的溫度下有效期為1年。配制完成的誘導培養(yǎng)基于2-8 ℃保存，穩(wěn)定儲存1-2周。

適用細胞：

適用于人胚胎干細胞、人誘導多能干細胞向定型內(nèi)胚層分化。

產(chǎn)品介紹

人多能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）包括人胚胎干細胞（hESCs）和誘導性多潛能干細胞（iPSCs）。體外hPSCs定向肝細胞、肺細胞、胰島細胞等方向分化均需要先分化為定型內(nèi)胚層細胞（definitive endoderm cells）。定型內(nèi)胚層經(jīng)典的分化方法用時3天，因分化過程中添加高濃度的活化素A（100 ng/ml，Activin A），會導致分化的同時細胞大量死亡。為提高細胞存活率，通常會添加一定濃度的血清。但血清成分復雜，提高細胞存活率的同時也嚴重影響分化效率（使用血清后流式檢測定型內(nèi)胚層細胞標志物SOX17及FOXA2往往低于50%）。這也最終導致肝細胞、肺細胞、胰島細胞等終末分化細胞分化效率更低，難以滿足下游實驗的需求。本產(chǎn)品主要針對定型內(nèi)胚層分化過程中細胞大量死亡和血清導致的分化效率低下進行產(chǎn)品優(yōu)化，最終形成無血清培養(yǎng)方案，明顯降低了誘導過程中的細胞死亡率，且誘導后流式/免疫熒光檢測定型內(nèi)胚層細胞標志物SOX17及FOXA2陽性率較高。

操作方法

實驗準備

• 誘導培養(yǎng)基配制：

• 血清替代品處理：室溫解凍血清替代品（RC200127）。融化后輕輕充分搖勻，分裝備用，或直接以20%的比例添加到RPMI1640培養(yǎng)基中。分裝后立即存儲于-80 ℃，避免反復凍融。

• 室溫解凍有利于保護血清替代品中營養(yǎng)物質不被破壞，切不可置于37℃水浴劇烈解凍，解凍后請務必充分混勻，以保證添加物的均勻度。

• 誘導培養(yǎng)基配制：將血清替代品（RC200127）以20%比例加入到RPMI1640培養(yǎng)基中，充分混勻，即配制成誘導培養(yǎng)基。使用時根據(jù)情況添加Activin A和CHIR99021（工作濃度Activin A為100 ng/ml，CHIR99021為2 μM）。

• 混合成誘導培養(yǎng)基必須充分混勻，2-8℃保存。整個過程確保無菌操作，試劑開封前以75%酒精擦拭表面。誘導培養(yǎng)基使用前置于室溫環(huán)境復溫，該操作適用于下列所有用到誘導培養(yǎng)基的步驟。

• 自備試劑：

• 多能干細胞*培養(yǎng)基

• 細胞消化液

• 無鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（DPBS）

• RPMI1640培養(yǎng)基

• Activin A

• CHIR99021

操作方法

1. 待分化細胞接種：分化前一天消化，接種hESCs/iPSCs。以24孔板進行誘導分化為例，確保分化開始加入誘導培養(yǎng)基時細胞匯合度大于90%，細胞貼壁時間大約為12-16小時。

2. hESCs/iPSCs 復蘇后狀態(tài)較差，建議傳代數(shù)次調(diào)整細胞狀態(tài)后種板開始誘導分化，建議傳代3次后開始種板誘導分化。細胞狀態(tài)和細胞培養(yǎng)中需要注意的細節(jié)，細胞消化、離心時間等可參考多能干細胞相關產(chǎn)品（RC200120、RC200121、RC200111）的相關說明。

1. 誘導起始：棄去培養(yǎng)上清，用誘導培養(yǎng)基輕柔地洗滌細胞2次。按照培養(yǎng)器皿的參考培養(yǎng)基添加量加入誘導培養(yǎng)基（含Activin A，含CHIR99021）。將器皿放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)基的參考添加量為24孔板500 μl/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培養(yǎng)皿15 ml/皿。

3. 特別提醒誘導培養(yǎng)基使用之前必須復溫。

1. 換液誘導：誘導24小時后，倒置顯微鏡觀察細胞。按照培養(yǎng)器皿的參考培養(yǎng)基添加量加入誘導培養(yǎng)基（含Activin A，含CHIR99021）。將器皿放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天換液，繼續(xù)誘導至72小時。

4. 誘導培養(yǎng)會對細胞進行篩選，細胞死亡為正?，F(xiàn)象。經(jīng)過72小時誘導后，細胞匯合度應大于80%。誘導培養(yǎng)基使用之前必須復溫，提前室溫放置復溫即可，切不可37℃水浴復溫。

1. 標志物檢測：經(jīng)過72小時誘導，細胞匯合度大于80%。定型內(nèi)胚層細胞呈三角形或多角形，流式細胞術檢測SOX17陽性率。

5. 該誘導終點只是其他實驗的起點，誘導終點的細胞難以長時間穩(wěn)定在該狀態(tài)，需要盡快進入后續(xù)實驗（大于72小時細胞會出現(xiàn)凋亡，因此需要每天固定時間點進行實驗），如肝臟細胞、胰島細胞、肺細胞等的誘導分化程序等。

6. 以上所有操作均在無菌細胞培養(yǎng)室進行，細胞開放操作要在生物安全柜內(nèi)進行；該研究常用的培養(yǎng)器皿包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板，也可自行設計方案使用細胞培養(yǎng)瓶、細胞工廠等，請根據(jù)實驗需要自行選擇；多能干細胞的初始狀態(tài)對分化的成功至關重要，請務必保證初始細胞未分化。該產(chǎn)品僅用于多能干細胞向定型內(nèi)胚層分化的研究，用于其他研究時該操作規(guī)程僅作為參考。

細胞形態(tài)展示：

鑒定結果：

應用示例：

1. 人胚胎干細胞源肺類器官分化

1. 人胚胎干細胞源肝細胞分化

參考文獻

1. Chen, Y; Feng, J; Zhao, S; Han, L; Yang, H; Lin, Y; Rong, Z; Long-Term Engraftment Promotes Differentiation of Alveolar Epithelial Cells from Human Embryonic Stem Cell Derived Lung Organoids, Stem cells and development, 2018, 27(19): 1339-1349.

2. Li, Q; Hutchins, A. P; Chen, Y; Li, S; Shan, Y; Liao, B; Zheng, D; Shi, X; Li, Y; Chan, W; Pan, G; Wei, S; Shu, X; Pei, D; A sequential EMT-MET mechanism drives the differentiation of human embryonic stem cells towards hepatocytes, Nature communications, 2017, 8(1): 1-12.