原理

RNA沉降（Pull down）主要是檢測(cè)蛋白質(zhì)與RNA之間的相互作用。首先把已知序列 的RNA做好標(biāo)記(例如biotin)，依靠這個(gè)標(biāo)記將RNA固定到某珠子(Beads) 上，再和含有蛋白質(zhì)的物質(zhì)，例如細(xì)胞裂解物共孵育，之后去掉未與RNA作用的上清。收集從珠子上洗下來(lái)的蛋白質(zhì)，如果蛋白質(zhì)是未知的，則要去作質(zhì)譜鑒定;如果想知道是不是某蛋白質(zhì)，則要作Western Blot鑒定。

基本思路

研究蛋白質(zhì)與RNA之間的相互作用，大致有兩種思路:①將RNA耦聯(lián)于珠子以富集與之相互作用的蛋白質(zhì);②用蛋白特異的抗體去免疫沉淀蛋白質(zhì)，再通過(guò)提取蛋白復(fù)合體中的RNA,利用QT-PCR等方法以檢測(cè)與之相互作用的RNA。

1. RNA耦聯(lián)珠子以富集與之相互作用的蛋白質(zhì)
 (1)高碘酸鹽耦聯(lián)法
 ①RNA-高碘酸鹽反應(yīng)。
 a.配制以下反應(yīng)體系。
 500 pmol RNA (100 個(gè)堿基的RNA 15μg，25個(gè)堿基的RNA4μg)
 40μL 1mol/L CH3COONa pH=5.0
 20μL 0.1mol/L高碘酸鹽(溶于水且新鮮配制)
 補(bǔ)水至400pL。
  b.室溫，置于旋轉(zhuǎn)儀上孵育1h (反應(yīng)管外包裏鋁箔紙)。
  c.加80μL 1mol/L CH3COONa (pH=5.0)，再加1mL 無(wú)水乙醇，-20°C，靜置1h。在此期間，開(kāi)始準(zhǔn)備珠子。
 d. 4℃，12000r/min, 10min， 70%乙醇洗一次后干燥;將干燥好的RNA沉淀用100μL CH3COONa (0.1mol/L)重懸。
 ②準(zhǔn)備珠子。
 a.將100μL乙二酸去瓊脂糖珠(含50%上清)在10mL離心管中洗滌，10mL0.1mol/L CH3COONa (pH5.0)洗3次，每次4℃，3000r/min, 5min,棄上清。
 b.用200μL 0.1 molyE CH3COONa (pH=5.0)重懸樣品。
 ③RNA-珠子結(jié)合反應(yīng)。
 a.將之前準(zhǔn)備好的300μL珠子加入高碘酸鹽處理好的RNA中。
 b.4℃置于旋轉(zhuǎn)儀上避光結(jié)合過(guò)夜(反應(yīng)管外包裹鋁箔紙)。
 c.4℃, 3000r/min, 5min,去上清，用1mL 2mol/L NaCl洗2次，然后將樣品移至1.5mLEP管，4℃，3000r/min, 5min, 棄上清。
  ④接下來(lái)，可選方案1或方案2。
 方案1如下。

a.洗RNA結(jié)合的珠子。
•用1mlL緩沖液D洗3次，4C，3000r/min, 5min，棄上清。
•100μL緩沖液D重懸。

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緩沖液D配方：20ml 40μL HEPES 2mL KCI 4μL EDTA 20μL DTT 1.2mL 甘油 20μL 酶抑制劑

b. RNA-Protein 結(jié)合反應(yīng)。
•準(zhǔn)備500μL RNA樣品反應(yīng)體系。
300μL緩沖液D
100μL目的蛋白（10-15μg/μL）
肝素(100μg/μL 儲(chǔ)存液稀釋至終濃度0.5-2.5~5.0μg/μL)
加酶抑制劑，按1:1000加。
補(bǔ)水至500μL。
•搖晃混勻。
•旋轉(zhuǎn)儀上孵育4h (4C)。
•4°C, 3000r/min, 5min, 盡可能棄去上清。
•1mL緩沖液D洗3次，每次置于旋轉(zhuǎn)儀上5min,去上清。
•加入50μL 2 X SDS.上樣緩沖液，煮樣10min,行Western Blot。
a.洗RNA結(jié)合的Beads
•用1.0mL緩沖液B，4°C 3000r/min, 5min,棄上清。
•100μL 緩沖液B重懸。

緩沖液B配方: 5mmol/L HEPES pH 7.9 1 mmol/L MgCI2 0.8mmol/L 乙酸鎂

b. RNA-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)。

•準(zhǔn)備500μL RNA樣品反應(yīng)體系。

50μL 10X結(jié)合緩沖液。

100μL目的蛋白(10-15μg/μL)

100μL結(jié)合了RNA的珠子

肝素(100μg/μL 儲(chǔ)存液稀釋至終濃度0.5-2.5~5.0μg/μL)加酶抑制劑，按1:1000加。

補(bǔ)水至500μL。

輕輕搖晃離心管，于旋轉(zhuǎn)儀上孵育30min,室溫。

•4℃，3000r/min,5min,盡可能棄去未結(jié)合的蛋白混合物。

•Buffer B洗5次(1mL)，4℃, 3000r/min, 5min，棄上清。

•加人50μL 2XSDS上樣緩沖液，煮樣，行Western Blot。

2.生物素-磁珠耦聯(lián)法

(1)實(shí)驗(yàn)原理

   使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。

(2)需要的試劑

亮抑酶酞，抑酶酞，胃酶抑素，HEPES等

(3)實(shí)驗(yàn)步驟

①胞漿蛋白提取。100mm培養(yǎng)皿(6X106細(xì)胞)，去培養(yǎng)基→PBS洗2次→沉淀用0.5mL胰蛋白酶消化加人PBS 2mL,反復(fù)吹打收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管，3000r/ min離心2min,棄上清，PBS重復(fù)洗1次。加人100μL緩沖液A，吸打混勻，冰浴15min。 加人緩沖液A (含2.5% NP40) 12. 5μL,輕緩顛倒混勻6次，4°C，4000r/min離心5min,上 清用于胞漿蛋白分析。

②探針標(biāo)記。Promega 試劑盒，Maxiscript T7 Kit, # 1312。

a.205mmol/NTP Mix。

b.體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

c.探針純化。

③沉降。

a.珠子處理。

b.Pull-down

c.煮樣，行Western Blot。

3.通過(guò)免疫沉淀蛋白以富集與之相互作用的RNA

(1)6盤(pán)10cm皿已經(jīng)長(zhǎng)滿(mǎn)的細(xì)胞。

(2)DEPC處理的PBS洗3遍，10mL/遍。最后用4mL PBS刮下細(xì)胞，并將細(xì)胞吹散。

(3)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，2000r/min 離心5min,棄上清。

(4)加人2mL (根據(jù)細(xì)胞量確定)免疫共沉淀緩沖液，吹勻細(xì)胞。冰上裂解20~30min，期間用1mL槍和2.5mL注射器將細(xì)胞裂解液吹散，使反應(yīng)充分進(jìn)行。

(5)將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至2個(gè)2mLEP管中，12000r/min 轉(zhuǎn)速離心20min離心后取上清。

(6)開(kāi)始準(zhǔn)備protein A/G珠子，取100pL珠子于1.5mL EP管中。用免疫共沉淀buffer洗3遍，再加人100μL免疫共沉淀緩沖液，將珠子均勻懸浮其中。

(7)將準(zhǔn)備好的beads與第(5) 步中的上清混合，4C旋轉(zhuǎn)1h。

(8)離心后，吸出液體，將液體平均分到2個(gè)EP管中，分別加入4μg抗體和NormalIgG，并都加入2μL RNase抑制劑，混勻，4℃，旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。

(9)準(zhǔn)備100μL珠子，方法同(6)，加入5μL RNase抑制劑(可選)。

(10)將(9)中的珠子每管加入26μL。4°C反應(yīng)L5h。

(11) 用免疫共沉淀緩沖液洗珠子，洗5遍。

(12) Trizol提取RNA。