產(chǎn)品簡介： 
     本產(chǎn)品主要用于spCas9 SpRY突變體體外酶切實(shí)驗(yàn)和靶點(diǎn)篩選等實(shí)驗(yàn)。SpCas9突變體SpRY識(shí)別的PAM序列為NRN（R為A/G）以及部分NYN（Y為C/T），與野生型spCas9的PAM序列NGG相比，極大的解除了PAM的限制，可供選擇的靶點(diǎn)更多。 
     
    本試劑盒可以在體外切割PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒等雙鏈DNA。 試劑盒中提供了SpCas9突變體SpRY蛋白，反應(yīng)緩沖液，以及對(duì)照sgRNA和底物DNA。使用該試劑盒可以快速開展體外酶切實(shí)驗(yàn)和篩選適合該突變體的靶點(diǎn)。 
   

產(chǎn)品規(guī)格：

活性定義：37℃，30分鐘切割1μg 1kB DNA雙鏈定義為1個(gè)活性單位。 
儲(chǔ)存條件：-20℃凍存

實(shí)驗(yàn)步驟： 
1、切割反應(yīng)： 
1.1需準(zhǔn)備：底物DNA，濃度大于100ng/ul；sgRNA，濃度大于200ng/ul。 
！務(wù)必采用無RNA酶的耗材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，注意防止RNA酶污染。 
按照下表配制SpRY體外切割反應(yīng)緩沖液，請(qǐng)按表中順序加入：

 陽性對(duì)照反應(yīng)：

1.2吹吸混合均勻。

反應(yīng)程序： 
37℃ 30min
85℃ 10min

2、產(chǎn)物檢測(cè)： 
快速檢測(cè)：

1. 在反應(yīng)體系中加入5μlCleaner，混勻。55℃孵育5min。（本步驟及以后的步驟不必使用無RNA酶耗材操作）

2. 取5μl進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)（不必加入DNALoadingBuffer）。

乙醇沉淀法檢測(cè)： 
本方案耗時(shí)約30min，電泳條帶更清晰。 
本步驟及以后的步驟不必使用無RNA酶耗材操作

1.加水將反應(yīng)產(chǎn)物補(bǔ)足50μl。

2.加入50μl酚氯仿異戊醇試劑。震蕩混勻。

3.室溫12000rpm離心5min。

4.取上清至新的1.5ml離心管，加入5 μl 3M NaAc pH5.2，混勻。

5.加入110μl無水乙醇，混勻。

6.4℃ 12000rpm離心10min。

7.去除上清，加入500μl 70%乙醇，震蕩混勻。

8.4℃ 12000rpm離心5min。

9.去除上清，空離心2min，12000rpm，用移液器盡量吸去殘留液體，開口室溫放置     2-5min。

10.加入10-15μl蒸餾水，震蕩溶解沉淀。

取3-5μl進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。 
2、陽性對(duì)照電泳結(jié)果： 
陽性對(duì)照DNA為760bp 雙鏈DNA。含有單一靶點(diǎn)。切割產(chǎn)物為兩條帶分別是505bp左右和255bp左右。 

M：DL2000 DNA marker
1：SpRY蛋白不加gRNA切割30min
2：SpRY蛋白加gRNA1切割30min
3：SpRY蛋白加gRNA2切割30min
4：SpRY蛋白加gRNA3切割30min

產(chǎn)品保存和使用注意事項(xiàng)：

1. SpRY蛋白使用過程中盡量保持低溫。

2. 陽性對(duì)照sgRNA需用無RNA酶槍頭取用，以免RNase污染導(dǎo)致降解。

3. 若切割效果不理想，可提高sgRNA的含量。

相關(guān)產(chǎn)品： 
sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒貨號(hào)：PC1380
Cas9體外酶切試劑盒貨號(hào)：PC1400