User Manual For PV2 DNA Polymerase

將聚合酶與緩沖液儲(chǔ)存于-20?C.

概述

PV2 DNA 聚合酶是一種超保真DNA聚合酶，該酶結(jié)合了雜交技術(shù)與融合技術(shù)以獲得*的可靠性、高特異性和長(zhǎng)的目標(biāo)長(zhǎng)度性能，顯著地減少全部的PCR延伸時(shí)間。通過(guò)融合一段增強(qiáng)區(qū)大大提高了持續(xù)合成能力，提高了PCR擴(kuò)增速率，結(jié)合該酶的3’-5’核酸外切酶活性使得其保真性是普通Taq酶的數(shù)十倍。而該酶的dute結(jié)構(gòu)使其即便在有PCR抑制劑存在的情況下，也能快速有效的得到目的產(chǎn)物。

PV2 DNA 聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性，PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物為平末端。

優(yōu)勢(shì)

l                      保真度高：確保PCR復(fù)制的精確程度

l                      快速：延伸時(shí)間短（15-30秒/kb）

l                      方便：功能強(qiáng)勁，只需最少的優(yōu)化

l                      高產(chǎn)量：用更少的酶，獲得更高的產(chǎn)量

應(yīng)用

l                      高保真PCR

l                      快速PCR

l                      高通量PCR

l                      長(zhǎng)片段或困難模板擴(kuò)增

l                      克隆

儲(chǔ)存條件

20mM Tris-HCl（pH7.4 @ 25°C），100 mM KCl，1 mM DTT，0.1mM EDTA，穩(wěn)定劑，50% 甘油

反應(yīng)條件

50µl反應(yīng)體系中含有：1X PV2緩沖液，DNA模板，0.5µM上下游引物，0.2mM dNTP，3% DMSO（可選），1U PV2 DNA聚合酶。

單位定義

一個(gè)單位 PV2 DNA聚合酶可在 74°C，在 30 分鐘內(nèi)向不溶于酸材料中摻入 10 nmol脫氧核糖核苷酸。

熱失活

無(wú)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)建立

為了得到理想的PCR結(jié)果，我們建議所有的試劑使用前都要充分混勻并離心，整個(gè)反應(yīng)操作在冰上進(jìn)行，并迅速將反應(yīng)轉(zhuǎn)移到預(yù)bianxing（98°C）的PCR循環(huán)儀上。為避免PV2 DNA 聚合酶3’-5’核酸外切酶活性引起的引物降解，PV2 DNA 聚合酶要最后加入到反應(yīng)體系中。請(qǐng)注意，以下的操作步驟與其它標(biāo)準(zhǔn)聚合酶不同，因此以下推薦的反應(yīng)條件為zuijia反應(yīng)條件。

注意：PCR反應(yīng)建立后，將反應(yīng)物吸打混勻，短暫離心將液體收集到管底。如果使用的PCR循環(huán)儀沒(méi)有加熱蓋，可在樣品上覆蓋礦物油。

將PCR管從冰上轉(zhuǎn)移至預(yù)加熱（bianxing溫度98°C）的PCR儀上開(kāi)始熱循環(huán)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)指南                                                                                                

1.       模板:

使用高質(zhì)量、高純度的DNA模板可以提高PCR反應(yīng)的成功率 。50ul反應(yīng)體系建議的DNA模板用量建議如下：

如果DNA模板來(lái)自于cDNA合成反應(yīng)，DNA的體積應(yīng)該不超過(guò)總的反應(yīng)體積的10%。

2.       引物:

寡核苷酸引物長(zhǎng)度一般為20~40nt，GC含量一般為40~60%，可以使用Primer 5等軟件設(shè)計(jì)分析引物 。使用PV2 DNA聚合 酶時(shí) ，每條引物的終濃度為0.2~1μM，建議用量是0.5μM。

3.       Mg2+ 和添加劑:

由于PV2 DNA 聚合酶是一種鎂離子依賴型酶，故Mg2+濃度對(duì)其有著關(guān)鍵作用。在1X PV2緩沖液中Mg2+終濃度為1.5 mM。過(guò)量的Mg2+能穩(wěn)定DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，阻止DNAwanquanbanxing，以穩(wěn)定由于引物非正確結(jié)合模板位點(diǎn)引起的假陽(yáng)性。zuijiaMg2+濃度應(yīng)還受總dNTP的濃度、特定模板以及樣品緩沖液成分影響。如果引物或模板中含有像EDTA或EGTA等螯合劑時(shí)，則應(yīng)提高Mg2+的濃度。如需進(jìn)一步優(yōu)化， 可以使用MgCl2按0.5 mM濃度逐步提升調(diào)整。

對(duì)于復(fù)雜模板，如高GC含量的序列和帶有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，可以加入DMSO等添加劑提高反應(yīng)效率。建議DMSO的終濃度為3%，也可以以2%的濃度遞增優(yōu)化。需要注意的是由于DMSO可以降低引物的Tm值 ，因此如果DMSO濃度很高， 則需要降低退火溫度。PV2 DNA聚合酶也可以與其它添加劑兼容，如：甲酰胺或甘油。

4.       dNTP:

dNTP的反應(yīng)終濃度通常是各200 μM 。在使用PV2 DNA聚合酶時(shí)，不推薦使用dUTP和帶有niaomiding的引物或模板。

5.       PV2 DNA 聚合酶:

我們推薦PV2 DNA聚合酶的使用濃度是20 U/ml (1.0 U/50 μl 反應(yīng)體系)。根據(jù)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度和困難程度，可以對(duì)PV2 DNA聚合酶在10–40 U/ml (0.5–2 U/50 μl 反應(yīng)體系) 之間進(jìn)行優(yōu)化。50 µl反應(yīng)體系中PV2 DNA聚合酶的用量不要超過(guò)2 U，尤其當(dāng)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度大于5 kb時(shí)。

6.       緩沖液:

隨酶提供5X PV2緩沖液。當(dāng)進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)該緩沖液是默認(rèn)的推薦緩沖液。

7.       Bianxing:

我們推薦大多數(shù)模板的預(yù)bianxing溫度及時(shí)間是98°C 與 30s。對(duì)于需要延長(zhǎng)bianxing時(shí)間的模板，預(yù)bianxing時(shí)間可以增加到3min。

在 PCR過(guò)程中，bianxing時(shí)間越短越好，大多數(shù)模板通常在98°Cbianxing時(shí)間是5~10s即可。

8.       退火:

與其它PCR聚合酶相比PV2 DNA 聚合酶需要較高的bianxing溫度 。PV2 DNA 聚合酶具有穩(wěn)定引物和模板雜交的性能，當(dāng)引物長(zhǎng)度大于20nt時(shí)，退火溫度在zuidiTm的基礎(chǔ)上加3°C復(fù)性10~30s；但當(dāng)引物長(zhǎng)度小于或等于20nt時(shí)，退火溫度為zuidi的Tm?？梢愿鶕?jù)需要建立溫度梯度去尋找引物和模板結(jié)合的zuishi溫度，這個(gè)梯度溫度以zuidi的Tm逐步提升到模板延伸溫度（兩步PCR）。

對(duì)于Tm較高的引物用兩步PCR法可以不需要復(fù)性這一步。

9.       延伸:

延伸過(guò)程在72°C進(jìn)行，延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度和模板復(fù)雜度，復(fù)雜度較低時(shí)可用15s/Kb的延伸時(shí)間；復(fù)雜度較高的基因組DNA模板，延伸時(shí)間則應(yīng)為30s/Kb。對(duì)于有些cDNA模板，延伸時(shí)間可增加到40s/Kb。

10.       循環(huán)數(shù):

通常25~35個(gè)循環(huán)可以產(chǎn)生足夠的PCR產(chǎn)物。

11.       兩步法PCR:

當(dāng)引物的退火溫度≥ 72°C 時(shí)建議使用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

常規(guī)的兩步法PCR熱循環(huán)條件如下：

12.       PCR產(chǎn)物:

使用PV2 DNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物為平末端，如果產(chǎn)物用于克隆，建議使用平末端連接。如果需要進(jìn)行T/A克隆，在加A之前需要純化DNA，因?yàn)?/span>PV2 DNA 聚合酶會(huì)降解產(chǎn)生的突出端。