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蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南七

來(lái)源:廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司   2019年06月20日 10:06  

蛋白質(zhì)氧化 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南


在氧化環(huán)境條件下,盡管蛋白質(zhì)的幾個(gè)氨基酸都可能受影響,但有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸;甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亞砜(圖34)。
對(duì)甲硫氨酸殘基的氧化取決于其在蛋白質(zhì)中的位置。埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且與溶劑接觸的甲硫氨酸側(cè)鏈有可能被氧化。
氧化條件包括熱、過(guò)渡金屬的存在以及溶液中氧氣的存在。
同脫酰胺作用一樣,甲硫氨酸的氧化可能導(dǎo)致生物活性的喪失或減弱,或者,在一些情況下對(duì)生物活性無(wú)影響。
這取決于甲硫氨酸在蛋白質(zhì)中的位置。但另一方面,甲硫氨酸亞砜的存在說(shuō)明蛋白質(zhì)經(jīng)受過(guò)氧化條件,因此甲硫氨酸氧化可以指示蛋白質(zhì)經(jīng)受過(guò)脅迫條件。

34. 在氧化環(huán)境條件下,甲硫氨酸被氧化為甲硫氨酸亞砜。

 

35. 天然蛋白水解產(chǎn)生的重組人凝血因子VIIa的一氧化物和二氧化物的反相色譜法分離。

 

 

條件

色譜柱:C4 寬孔柱, 4.6 x 250 毫米

流動(dòng)相:37~47% 乙腈-0.1% TFA體系,30分鐘梯度洗脫。

樣品:被過(guò)氧化氫部分氧化的重組人凝血因子 VIIa。

 

通常會(huì)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)治療藥物的氧化反應(yīng),因?yàn)樗瓤赡苡绊懮锘钚?,也可作為一種指示。
甲硫氨酸的氧化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性下降,因此在反相HPLC中,氧化蛋白會(huì)先于天然蛋白洗脫出來(lái),如圖35所示。
重組人凝血因子VIIa(rCF VIIa)被過(guò)氧化氫部分氧化后利用反相HPLC對(duì)溶液進(jìn)行分析。
氧化蛋白(兩個(gè)甲硫氨酸殘基被氧化)先洗脫出來(lái)。
只有一個(gè)甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白隨后洗脫出來(lái),后是天然蛋白。四種蛋白具有良好的分辨率。
尤其是只有一個(gè)甲硫氨酸被氧化的兩種蛋白間分辨率很高。這幾種蛋白均有一個(gè)氧化甲硫氨酸,僅區(qū)別于被氧化甲硫氨酸的不同。

通常利用肽圖監(jiān)測(cè)甲硫氨酸的氧化。
如圖36所示,含氧化甲硫氨酸的多肽比含天然甲硫氨酸的多肽出峰時(shí)間早很多。
T2 metox 先于天然T2胰蛋白酶水解片段洗脫出來(lái);T11 metox先于天然 T11洗脫出來(lái),使得鑒別和監(jiān)測(cè)更容易。

 

圖36. 部分氧化的人生長(zhǎng)激素的肽圖。

 

條件

色譜柱:C18寬孔柱,4.6 x 250 mm

流動(dòng)相:0~40% 乙腈—0.1% TFA體系,梯度洗脫,120分鐘。

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