四環(huán)冷凍干燥機(jī)廣泛用于制備治療性蛋白質(zhì)制劑，蛋白凍干制劑可以提供更好的保質(zhì)期，方便藥物的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。然而，蛋白在凍干過程中存在許多應(yīng)力，包括低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力(枝狀冰晶的形成、離子強(qiáng)度的增加、pH值的改變、相分離等)、干燥應(yīng)力(失去蛋白質(zhì)表面水分子)等，這些應(yīng)力常常直接或間接導(dǎo)致蛋白質(zhì)類藥物失去天然構(gòu)象從而變性或失活。所以即使采用了冷凍干燥這種溫和的干燥方式，還需要加入合適的凍干保護(hù)劑以很好的保護(hù)蛋白穩(wěn)定性。

       冷凍干燥保護(hù)劑對(duì)于蛋白質(zhì)的保護(hù)原理已經(jīng)被研究討論了幾十年，形成了一些被普遍接受的共識(shí)。如在凍結(jié)階段，主要的假說為“優(yōu)先化作用”;在干燥階段主要的有2種假說，即“玻璃化”和“水置換”。

      冷凍干燥保護(hù)劑的分類方式很多，有文獻(xiàn)中提出了一個(gè)公式化模型，按照功能把冷凍干燥保護(hù)劑分類，包括5類: ①pH緩沖劑，如Tris、組氨酸、枸櫞酸等;②配體，可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的熱力學(xué)穩(wěn)定性;③穩(wěn)定劑，一般是雙糖，如蔗糖、海藻糖等，可通過抑制蛋白質(zhì)的展開和提供玻璃基質(zhì)起保護(hù)作用;④非離子表面活性劑，可減少蛋白質(zhì)的聚集;⑤填充劑，如甘露醇、甘氨酸、羥乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高產(chǎn)品的物理成型性。這里我們簡要介紹其中幾種。

      為了保證冷凍干燥后形成良好的配方結(jié)構(gòu)防止產(chǎn)品塌陷，同時(shí)改善配方溶解性，冷凍干燥保護(hù)劑中還需要加入填充劑。首先，填充劑在復(fù)溶時(shí)應(yīng)該是充分可溶的并且與制劑中的蛋白質(zhì)藥物相容。此外，它們沒有毒性問題并且具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可有效提高冷凍干燥效率。

        甘氨酸和甘露醇經(jīng)常用作凍干蛋白質(zhì)制劑的填充劑。甘氨酸在用作填充劑時(shí)具有優(yōu)勢，因?yàn)樗菬o毒的。它具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可實(shí)現(xiàn)高效冷凍干燥和高溶解度。

      甘露醇具有與甘氨酸相同的優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)特定蛋白質(zhì)藥物如LDH和轉(zhuǎn)化生長因子-b1具有穩(wěn)定作用，其穩(wěn)定效果取決于其濃度。因此，在選擇填充劑時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮穩(wěn)定效果以及粉餅外觀。大多數(shù)氨基酸容易結(jié)晶并且可以潛在地用作填充劑以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，然而，酸鹽的形成阻礙了它們的結(jié)晶。 NaCl是另一種結(jié)晶劑，但其共熔溫度(Teu)相對(duì)于其他填充劑的而言太低，因此不推薦使用。

      對(duì)于填充劑，應(yīng)考慮退火步驟。甘氨酸和甘露糖醇在冷凍干燥過程中應(yīng)以結(jié)晶形式存在。 但是在冷凍步驟期間，過冷卻誘導(dǎo)兩種填充劑以無定形形態(tài)凍結(jié)，容易導(dǎo)致粉餅塌陷。另外，在沒有退火的情況下，填充劑可以在初級(jí)干燥期間重結(jié)晶造成西林瓶破裂，特別是當(dāng)制劑中包含高濃度的甘露醇時(shí)。填充劑應(yīng)在非晶相的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)和填充劑的共熔溫度(Teu)之間進(jìn)行有效結(jié)晶，而退火時(shí)間取決于填充劑濃度及其性質(zhì)。 對(duì)于甘露醇和甘氨酸，填充高度在1cm時(shí)，推薦在-20或-25℃和2小時(shí)。

      多元醇廣泛用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^其羥基穩(wěn)定蛋白質(zhì)。多元醇已被用作冷凍保護(hù)劑和凍干保護(hù)劑。例如，在凍融期間，LDH在不同程度上受甘油，木糖醇，山梨糖醇和甘露醇的保護(hù)。

      聚合物已被用作蛋白質(zhì)溶液和凍干制劑的保護(hù)劑。血清白蛋白是用于蛋白質(zhì)藥物開發(fā)的廣泛使用的聚合物之一，作為凍干保護(hù)劑和冷凍保護(hù)劑。許多上市蛋白質(zhì)藥物含有不同量的白蛋白(表1)。但是，血清白蛋白具有與血源性病原體相關(guān)的潛在污染物，限制了其在蛋白質(zhì)藥物制劑中的使用。因此，建議rHA替代血清白蛋白。終，建議在沒有白蛋白的情況下開發(fā)蛋白質(zhì)藥物。

      在冷凍步驟中，形成冰水界面可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面變性。表面活性劑降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力，保護(hù)其免受表面變性。廣泛使用的表面活性劑之一是Tween 80。