緩沖液是一種含有弱酸及其共軛堿（或弱堿及其共軛酸）的水溶液。加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿后，緩沖溶液的 pH 值變化很小，當(dāng)小的環(huán)境因素發(fā)生變化時(shí)，有助于抵消分析方法中的條件變化。緩沖溶液用于將 pH 值保持在幾乎恒定的值。由于這種弱酸 (HA) 與其共軛堿之間存在平衡，它們對(duì) pH 變化具有抵抗力。

        一、hplc緩沖液的工作原理

        當(dāng)一些強(qiáng)酸（更多的 H+）被添加到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時(shí)，根據(jù) Le Chatelier 原理，平衡向左移動(dòng)。類似地，如果將強(qiáng)堿添加到混合物中，則氫離子濃度降低的量小于所添加堿量的預(yù)期量。

        在準(zhǔn)備緩沖液時(shí)，您應(yīng)該遵守一些一般準(zhǔn)則：

校準(zhǔn) pH 計(jì)；理想情況下，pH 值高于和低于緩沖液制備的目標(biāo)值；

稱出緩沖鹽以提供所需的緩沖濃度；

加入裝有 HPLC 級(jí)水的容量瓶中，充分混合溶解；

使用 pH 探針和 pH 計(jì)，測(cè)量溶液的 pH；

通過添加少量強(qiáng)酸和/或強(qiáng)堿將 pH 值調(diào)節(jié)至所需值；

一旦 pH 值正確，將溶液稀釋至最終所需體積并充分混合。

        在 HPLC 中，緩沖液通常用于控制在色譜領(lǐng)域中通常被視為“不需要”的二級(jí)相互作用。它們還用于控制分析物的電離狀態(tài)，以確保它不會(huì)以一種以上的電離狀態(tài)存在?；衔锏?pKa 表示其 50% 離子化和 50% 中性的 pH 值。如果您在這個(gè) pH 值下工作，您將看到分裂峰和可變的保留時(shí)間。所有方法都應(yīng)努力使其遠(yuǎn)離目標(biāo)分析物的 pKa 至少兩個(gè) pH 單位。

        二、準(zhǔn)備好的流動(dòng)相

        在制備等度流動(dòng)相時(shí)，需要進(jìn)一步考慮以確保良好的方法穩(wěn)定性。

        盡可能預(yù)混合您的流動(dòng)相，這將消除泵的錯(cuò)誤。始終使用相同的方法進(jìn)行準(zhǔn)備；例如，如果您先加水，則應(yīng)始終先加水。如果您測(cè)量單個(gè)組件然后混合，則應(yīng)始終以這種方式進(jìn)行。請(qǐng)勿更改此過程，因?yàn)榉治鑫锉Ａ魰r(shí)間的結(jié)果可能會(huì)有很大差異。

        HPLC 中分析物的保留時(shí)間由流動(dòng)相的極性控制。HPLC 的流動(dòng)相通常使用可混溶的有機(jī)溶劑和水/緩沖液的非極性和極性混合物/組合。選擇合適的流動(dòng)相是 HPLC 方法開發(fā)的一個(gè)重要方面。在使用流動(dòng)相和緩沖液之前，應(yīng)使用溶劑進(jìn)樣口過濾器將其過濾，并對(duì)所有水性和有機(jī)溶劑進(jìn)行脫氣，以去除所有顆粒雜質(zhì)并溶解氣體。不銹鋼材質(zhì)更耐腐蝕，無(wú)需工具或配件，有效防止顆粒進(jìn)入您的泵。

        三、準(zhǔn)備好的流動(dòng)相

        緩沖液濃度也很重要，通常認(rèn)為低于 10mM 的濃度不能提供控制硅醇活性或化合物的電離狀態(tài)所需的緩沖能力，而 10mM 將被認(rèn)為是反相和 HILIC 的最小有效濃度。對(duì)于其他技術(shù)（例如尺寸排除），需要顯著更高的濃度，并且這些方法的濃度超過 100 mM 的情況并不少見。緩沖液濃度必須仔細(xì)平衡，以確保在所有條件下都能達(dá)到溶解度。在反相條件下工作時(shí)，如果方法包含高水平的有機(jī)物（例如跨梯度），您可能需要限制正在使用的緩沖液的濃度，以確保不會(huì)發(fā)生緩沖液沉淀。

        檢查所用溶劑的相容性、相對(duì)極性和混溶性。流動(dòng)相僅使用高純度溶劑，水應(yīng)為 HPLC 級(jí)或過濾和去離子，一般透明玻璃瓶用于儲(chǔ)存流動(dòng)相，因?yàn)椴ＡЬ哂谢瘜W(xué)惰性，便于目視檢查。

        流動(dòng)相對(duì)選擇性的貢獻(xiàn)不亞于固定相，在開發(fā)穩(wěn)健的 HPLC 色譜方法時(shí)，選擇和制備的注意與批量測(cè)試固定相同樣重要。