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【Zeno SWATH DIA新技術(shù)】皮克級(jí)超低上樣量下的穩(wěn)定蛋白質(zhì)組鑒定及定量
ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)配備的Zeno Trap（Zeno阱）功能激活后，可以使SWATH DIA工作流程中的肽段二級(jí)質(zhì)譜靈敏度提高5-6倍左右，使得蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程平臺(tái)中使用納克甚至皮克級(jí)樣品量成為可能。我們應(yīng)用Zeno SWATH IDA流程，對(duì)低進(jìn)樣量K562樣品進(jìn)行分析，使用納升液相系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和定量測(cè)試，并且評(píng)價(jià)了DIA-NN中使用基于自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫的分析流程。
液相方法：液相系統(tǒng)：M Class系統(tǒng)（Waters），色譜柱：EV-1106 色譜柱，15 cm x 150 μm，1.9 μm 粒徑，流速：300 nL/min，梯度：45min。
質(zhì)譜方法：質(zhì)譜：ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)，采集模式：Zeno SWATH DIA，可變窗口數(shù)：80個(gè)（m/z 400-903），一級(jí)累積時(shí)間：50毫秒，二級(jí)累積時(shí)間：18毫秒，源氣參數(shù)：離子源電壓3200 V，溫度225°C，Gas1 ：10 psi ，CUR gas ：20 psi。
數(shù)據(jù)分析：Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA- NN軟件處理，分別使用自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫流程，自建數(shù)據(jù)庫為之前由OneOmics建立的人細(xì)胞裂解液數(shù)據(jù)庫。
主要結(jié)果：
1.
低進(jìn)樣量時(shí)蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量
在不同進(jìn)樣量時(shí)測(cè)試蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量，可以看到在250 pg進(jìn)樣量時(shí)，K562樣品可以鑒定到880個(gè)蛋白質(zhì)( FDR<1%)，其中327個(gè)蛋白質(zhì)CV低于20% ( 圖1)。隨著樣品進(jìn)樣量的增加，蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量增加，進(jìn)樣5ng時(shí)鑒定出3752個(gè)蛋白( FDR<1%)，其中2457個(gè)蛋白CV低于20%?？瞻讟悠钒凑障嗤瑮l件進(jìn)行分析，未檢測(cè)到蛋白或多肽，說明工作流程可靠性。
圖1. 不同低進(jìn)樣量樣品中蛋白質(zhì)（左）
和肽段（右）的鑒定和定量數(shù)量
左圖透明柱狀圖代表global FDR<1%時(shí)蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量，實(shí)心柱狀圖代表FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質(zhì)數(shù)量。
2.
采用自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫時(shí)蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量對(duì)比
使用DIA-NN分別進(jìn)行基于自建數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)處理，以及直接從人類FASTA文件中生成理論數(shù)據(jù)庫的分析?？傮w而言，兩種數(shù)據(jù)處理方法蛋白質(zhì)鑒定的重疊程度很高，使用自建數(shù)據(jù)庫處理的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量略多(約4%)（圖2），二者共同鑒定到的蛋白質(zhì)為819個(gè)。
圖2. 使用數(shù)據(jù)庫與非數(shù)據(jù)庫分析流程中
蛋白質(zhì)鑒定數(shù)的對(duì)比
3.
Zeno SWATH IDA流程穩(wěn)定性測(cè)試
通過比較間隔1個(gè)月進(jìn)樣的2組實(shí)驗(yàn)來評(píng)估低進(jìn)樣量實(shí)驗(yàn)的日間重復(fù)性，每次實(shí)驗(yàn)對(duì)相同的K562原液進(jìn)行稀釋，使用Zeno SWATH DIA進(jìn)行分析?？梢钥吹?，在3種低進(jìn)樣量下，觀察到相近的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量（圖3）。
圖3. 用獨(dú)立稀釋的K562樣品進(jìn)行不同時(shí)間的比較
兩組實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)進(jìn)樣量樣品均進(jìn)行3次采樣。數(shù)據(jù)在DIA-NN軟件中使用基于自建數(shù)據(jù)庫的流程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。透明柱狀圖表示global FDR <1%的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)，實(shí)心柱狀圖帶表示FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質(zhì)數(shù)。
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