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1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；
2、取對數(shù)生長期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。
3、去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長的細(xì)胞消化下來；
4、離心1000rpm，5min；
5、去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；
6、細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5ml；
7、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者；
8、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
注意事項(xiàng)
1、從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞用于凍存，最好為對數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液；
2、將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護(hù)工作，以免凍傷；
3、凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。
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