免疫比濁法是目前非常主流的一種免疫檢測(cè)方法，其基本原理為：抗原抗體在緩沖液中特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，透光率下降。在一定的比例范圍內(nèi)，反應(yīng)液的濁度和抗原抗體的量呈線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系，從而得到樣液中抗原的含量。

免疫比濁中抗體的載體主要是膠乳微球，常見(jiàn)的膠乳微球由苯乙烯及相應(yīng)功能單體通過(guò)乳液聚合法制得，粒徑范圍為50nm至400nm的一種納米材料。膠乳微球的粒徑會(huì)影響免疫比濁靈敏度大小、抗體投入量多少、包被微球的抗體活性及微球本身穩(wěn)定性等，因此精準(zhǔn)監(jiān)控膠乳微球的粒徑分布情況，團(tuán)聚、分散等狀態(tài)也成為微球的生產(chǎn)包被工藝流程中的重難點(diǎn)。

免疫比濁試劑的研發(fā)過(guò)程中，需要對(duì)裸露的膠乳微球進(jìn)行包被以及封閉操作，而在微球包被、封閉結(jié)束后，通常需要通過(guò)高速離心的方法去除多余的蛋白和封閉劑，在離心之后又需要超聲使微球均勻懸浮在液體當(dāng)中。令人頭疼的是，超聲不足，微球不能充分分散；超聲過(guò)度，可能造成抗體或封閉劑從微球表面脫落，容易造成微球聚集、沉淀。

微球顆粒越大、濃度越高吸光度也會(huì)增大，所以經(jīng)常會(huì)用紫外分光光度法測(cè)量微球的吸光度來(lái)反應(yīng)微球樣本的團(tuán)聚或者濃度情況。筆者通過(guò)紫外分光光度法研究了150nm微球包被前后的變化情況，檢測(cè)了包被前的裸露150nm微球的吸光度為0.68A，包被后微球吸光度為1.11A，就說(shuō)明包被后樣本團(tuán)聚嚴(yán)重。超聲分散后，檢測(cè)微球吸光度為0.60A，此時(shí)微球吸光度與裸微球的吸光度相近，說(shuō)明微球已超聲分散好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

但發(fā)現(xiàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期有較大的偏差。猜想雖然包被后超聲的微球吸光度與裸微球的吸光度相近，但微球的狀態(tài)很可能不一樣，而紫外分光光度計(jì)無(wú)法檢測(cè)到這樣的細(xì)節(jié)，分辨率較低。因此需要一款高精度的納米顆粒表征儀器，目前高精度的納米單顆粒表征方法有納米粒子示蹤（NTA）、納米流式、納米庫(kù)爾特粒度儀（Nanocoulter），但是前兩種方法都是光學(xué)方法，易受樣本的光學(xué)性質(zhì)影響。Nanocoulter運(yùn)用RPS（電阻感應(yīng)脈沖）原理，RPS作為電學(xué)的檢測(cè)方法，不存在大小顆?；ハ嘤绊懙默F(xiàn)象，是真正意義上的單顆粒檢測(cè)方法，反映樣本最真實(shí)的粒徑分布。而且不受樣本吸光度、折光率影響，與樣本光學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)，擁有非常高的分辨率，可以精確看到樣本團(tuán)聚等細(xì)微變化。

筆者選用了Nanocoulter檢測(cè)微球包被過(guò)程中各步驟的顆粒濃度。數(shù)據(jù)顯示150nm裸微球濃度為5.338E+11（Particles/mL），且粒徑集中在150nm處，樣本中只有微量團(tuán)聚體，微球的均一性很好；包被后的微球，樣本中的團(tuán)聚明顯增多，與吸光度反映一致；而包被微球超聲后，濃度為4.602E+11（Particles/mL），相比裸微球，包被后超聲微球濃度明顯下降，樣本損失了13.8%。而且超聲后的微球并沒(méi)有分散好，樣本中還有10%左右的團(tuán)聚顆粒。

至此，筆者確定先前引起吸光度降低的原因，就是因?yàn)楣に囘^(guò)程中微球的損失導(dǎo)致。另外，超聲后吸光度雖降低，但微球中其實(shí)還是有部分團(tuán)聚體，這種情況是分光光度計(jì)無(wú)法準(zhǔn)確分析的。甚至因?yàn)閾p失，分光光度計(jì)還會(huì)在遇見(jiàn)團(tuán)聚體時(shí)給出“分散較好”的誤導(dǎo)信息！但實(shí)際上，微球吸光度一致時(shí)，微球的團(tuán)聚情況也可能不同。

總結(jié)

納米庫(kù)爾特粒度儀（電阻法RPS）在免疫比濁試劑生產(chǎn)研發(fā)中有明顯優(yōu)勢(shì)：

1. 粒徑測(cè)量媲美電鏡，可以準(zhǔn)確展示微球的粒徑分布，分析團(tuán)聚情況；

2. 精準(zhǔn)的濃度測(cè)量，分析微球包被工藝當(dāng)中的損失及分散情況；

3. 真正意義上的單顆粒檢測(cè)，展示樣本的原始面貌。