1、蛋白為什么要凍干？?jī)龈蓪?duì)蛋白的影響有哪些？

答：蛋白質(zhì)對(duì)熱敏感，凍干能使絕大部分蛋白質(zhì)的活性保留下來，提高蛋白的穩(wěn)定性并延長(zhǎng)保存時(shí)間，同時(shí)降低運(yùn)費(fèi)。
凍干有可能會(huì)造成蛋白的活性部分損失，聚集和其它變性問題。但可以通過添加保護(hù)劑（穩(wěn)定劑，添加劑，輔料）和控制凍干的各種條件來盡可能降低這些負(fù)面的影響。
溫馨提示南京卡米洛提供的蛋白產(chǎn)品一般為凍干粉，它們?cè)谑覝貤l件下非常穩(wěn)定(至少1個(gè)月)。盡管如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃ ，以確保蛋白的活性。
 
2、凍干前為什么向蛋白溶液中加保護(hù)劑？一般凍干保護(hù)劑有哪幾種？你們的產(chǎn)品通常加的保護(hù)劑是什么？
答：保護(hù)劑是用來在凍干和儲(chǔ)存過程中保護(hù)蛋白的。常用的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑有糖類，多元醇，聚合物，表面活性劑，某些蛋白和氨基酸等。我們通常加8%（質(zhì)量比體積）的海藻糖和mannitol作為凍干保護(hù)劑。海藻糖可明顯阻止蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變以及凍干過程中蛋白質(zhì)的伸展和聚集；mannitol也是一種普遍應(yīng)用的凍干保護(hù)劑和填充劑，可以降低某些蛋白的凍干后聚集情況。
溫馨提示：對(duì)于大多數(shù)蛋白，重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長(zhǎng)期保存，請(qǐng)先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后分裝凍存于-20oC或-80oC。一定要避免反復(fù)凍融，因每次凍融均會(huì)引起蛋白的部分失活。
 
3、為什么我的管內(nèi)幾乎看不見蛋白產(chǎn)品？
答：武漢華美的蛋白產(chǎn)品中不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等，并以低含鹽量的溶液進(jìn)行凍干時(shí)，常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。
溫馨提示：在打開管蓋前，我們建議您在小離心機(jī)中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準(zhǔn)確無誤，雖然有時(shí)您無法看到蛋白粉末，但管中的蛋白含量仍是非常精確的。
 
4、應(yīng)如何確定細(xì)胞因子的種屬交叉活性？
     答：1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子對(duì)小鼠細(xì)胞均有活性。2) 許多小鼠細(xì)胞因子也可作用于人類細(xì)胞，但比活性可能低于對(duì)應(yīng)的人類細(xì)胞因子。 3) IL-7等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時(shí)比對(duì)應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強(qiáng)。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細(xì)胞因子種屬特異，對(duì)非同源細(xì)胞幾乎沒有活性。5) 相反，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動(dòng)物種屬細(xì)胞上均具有很好的活性。
 
5、應(yīng)如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品？ 
第1步：開蓋前離心試劑管。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉全部溶解。一般需要3000-3500rpm離心5min，效果良好。
第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。
1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。產(chǎn)品說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白全部溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能全部溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
2) 一定要溶解到目標(biāo)濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，一般為0.1-1.0 mg/ml。但這一濃度范圍對(duì)于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃度范圍時(shí)細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法全部溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
3) 一定不能振蕩(vortex)。這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。請(qǐng)用放至室溫的緩沖液作為溶劑。加緩沖液后，蓋好瓶塞，輕輕用手翻轉(zhuǎn)瓶子或把瓶子放在一個(gè)緩慢搖擺的搖床上。這樣做來保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個(gè)內(nèi)壁。 讓瓶子在室溫放置至少10 - 15分鐘，然后可以進(jìn)行分裝或使用。
第3步：該重懸液在2-8oC最長(zhǎng)可保存1周。
用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8oC，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性最長(zhǎng)可保持1周。這對(duì)一個(gè)周期為5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
其實(shí)，說明書上推薦的濃度對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)來講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在4oC保存，待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
第4步：如要長(zhǎng)期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20oC至-80oC。
如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對(duì)細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長(zhǎng)期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20oC至-80oC，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
即在做無血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，要想長(zhǎng)期保存細(xì)胞因子或重組蛋白則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。