體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)常見問題與解答

—熱點(diǎn)問題—

第一題    細(xì)胞被“黑膠蟲”污染了該如何處理？

如果培養(yǎng)的細(xì)胞被“黑膠蟲”污染，需先去評估污染的嚴(yán)重程度。如果污染不嚴(yán)重，可選用市售的“黑膠蟲”清除試劑進(jìn)行處理；如果污染較嚴(yán)重，建議直接丟棄該細(xì)胞，分析造成“黑膠蟲”污染的原因并進(jìn)行治理。

第二題    CHL細(xì)胞為試驗(yàn)系統(tǒng)，細(xì)胞準(zhǔn)備時(shí)推薦的接種密度是多大？接種后培養(yǎng)多久可以開始染毒？

本公司使用T25瓶進(jìn)行試驗(yàn)，接種密度為6~9×10^4/mL，接種量為5mL，即每瓶細(xì)胞量是3×10^5個~4.5×10^5個。一般情況下，接種后24h左右細(xì)胞的融合率可達(dá)到80%即可進(jìn)行染毒，如果融合率不夠，也可以繼續(xù)培養(yǎng)直至滿足試驗(yàn)需求。

第三題    一般如何確定秋水仙素的濃度和處理時(shí)間??？

秋水仙素劑量大，則作用時(shí)間短；秋水仙素劑量小，則適當(dāng)延長作用時(shí)間。本公司使用的秋水仙素濃度是1μg/mL，4h。

第四題    秋水仙素工作的機(jī)理是什么？

秋水仙素可以抑制紡錘體的形成，導(dǎo)致紡錘絲無法捕捉到著絲粒而造成染色體不能向細(xì)胞兩極移動。同時(shí)，秋水仙素處理后，染色體將會不能排列在赤道板，所以在細(xì)胞中會散亂分布。

第五題    細(xì)胞收集量少是什么原因?qū)е碌?？如何?yōu)化？

細(xì)胞收集量少的原因主要有以下幾點(diǎn)：

（1）酶消化過程消化不干凈；

（2）離心速度過低，細(xì)胞不能沉淀，導(dǎo)致細(xì)胞丟失；

（3）鋪板細(xì)胞量不夠；

（4）樣品對細(xì)胞有毒性，細(xì)胞死亡。

優(yōu)化策略：

（1）酶消化過程需于顯微鏡下觀察，確保消化完；

（2）適宜的離心條件，通常250g，5min;

（3）細(xì)胞懸液需混合均勻，必要時(shí)多次計(jì)數(shù)；

（4）如有需求，請于正式試驗(yàn)前開展預(yù)試驗(yàn)。

第六題    低滲目的是什么？有什么注意事項(xiàng)？

在低滲環(huán)境中，細(xì)胞易吸水膨脹，染色體鋪展，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態(tài)，為后續(xù)染色做準(zhǔn)備。在低滲過程中我們需要注意以下幾點(diǎn)：

（1）低滲時(shí)間。低滲時(shí)間過長，可引起細(xì)胞破裂，染色體丟失；低滲時(shí)間不足，細(xì)胞膨脹度不夠，染色體聚集，分散不好，不利于閱片。本公司低滲是使用0.075mol/L的氯化甲溶液37℃水浴30~40min。

（2） 細(xì)胞操作需輕柔。低滲后的細(xì)胞會脹大，通透性增強(qiáng)，細(xì)胞操作過程一定要輕柔，以防細(xì)胞破裂。

（3）離心條件需適合。低滲后細(xì)胞膨脹，離心力過高，細(xì)胞容易破裂，導(dǎo)致染色體丟失；離心力過低，細(xì)胞不能沉淀，收集不到細(xì)胞。

第七題    細(xì)胞在固定過程中丟失是什么原因?qū)е碌模?/span>

細(xì)胞在固定過程中丟失可能是因?yàn)殡x心速度過低，細(xì)胞不能沉淀或沉淀不夠，在更換固定液的過程中導(dǎo)致細(xì)胞丟失。

第八題    每次固定的時(shí)間是多久？固定幾次比較合適？

本公司使用的是預(yù)固定加重復(fù)固定的方法。預(yù)固定在低滲結(jié)束前進(jìn)行，一般3~5min，步驟雖簡單卻不能省略，可有效預(yù)防細(xì)胞因加入大量的固定液而凝結(jié)成塊。固定步驟共重復(fù)3次，一般30±5min。

第九題    玻片干燥怎么操作？

可于室溫下自然干燥，也可于37℃干燥箱中烘干。

第十題    使用吉姆薩染液同樣條件下染片，為什么會出現(xiàn)有的片子是藍(lán)色的，有的是紅色的？

根本原因是因?yàn)槿旧^程中pH的變化。吉姆薩染液由天青，伊紅組成，所帶電荷隨溶液PH而定。在偏酸性環(huán)境中下在電荷增多易與伊紅結(jié)合染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多,易與美藍(lán)或天青結(jié)合,染色偏藍(lán)。

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