一、ELISA基本原理

ELISA通過(guò)抗原-抗體的特異性結(jié)合，利用酶催化底物顯色反應(yīng)進(jìn)行定量或定性分析。常見(jiàn)的類(lèi)型包括直接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，但其核心步驟均依賴(lài)于以下三類(lèi)關(guān)鍵試劑。

二、核心試劑一：包被抗體/抗原——實(shí)驗(yàn)的“基石”

作用：作為固相載體（微孔板）的固定化分子，捕獲目標(biāo)物。

純度與活性：高純度避免交叉反應(yīng)，確保結(jié)合效率（建議使用單克隆抗體）。

包被濃度優(yōu)化：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度（通常1-10 μg/mL），濃度過(guò)高易導(dǎo)致空間位阻。

緩沖液選擇：碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）常用，避免含BSA或Tween的溶液。

常見(jiàn)問(wèn)題：

非特異性結(jié)合：增加封閉步驟（如5%脫脂牛奶或BSA封閉1小時(shí)）。

包被不均：4℃過(guò)夜包被優(yōu)于室溫2小時(shí)，提高結(jié)合穩(wěn)定性。

三、核心試劑二：酶標(biāo)抗體——信號(hào)的“放大器”

作用：與目標(biāo)物結(jié)合后催化底物顯色，將生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)。

HRP（辣根過(guò)氧化物酶）：常用，底物為T(mén)MB（顯藍(lán)色）或OPD（顯黃色），靈敏度高。

AP（堿性磷酸酶）：底物為pNPP（顯黃色），適用于磷酸鹽緩沖體系。

標(biāo)記效價(jià)：高效價(jià)減少用量，降低成本（建議效價(jià)≥1:5000）。

保存條件：HRP需避光保存，避免反復(fù)凍融（分裝后-20℃儲(chǔ)存）。

注意事項(xiàng)：

避免與疊氮鈉（HRP抑制劑）共用，可選擇ProClin 300作為防腐劑。

四、核心試劑三：底物顯色系統(tǒng)——結(jié)果的“可視化”

作用：酶催化底物生成有色產(chǎn)物，通過(guò)吸光度值定量目標(biāo)物濃度。

常用底物對(duì)比：

優(yōu)化技巧：

顯色時(shí)間控制：室溫避光反應(yīng)10-30分鐘，避免過(guò)度顯色導(dǎo)致背景升高。

終止時(shí)機(jī)：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度孔顯色明顯時(shí)立即終止。

五、實(shí)驗(yàn)流程關(guān)鍵步驟

包被：100μL/孔，4℃過(guò)夜。

封閉：含1% BSA的PBS，37℃1小時(shí)。

加樣：樣本梯度稀釋?zhuān)?7℃孵育1小時(shí)。

酶標(biāo)抗體孵育：37℃1小時(shí)，洗滌3次（0.05% Tween-20 PBS）。

顯色與終止：TMB顯色15分鐘，2M H?SO?終止。

讀數(shù)：雙波長(zhǎng)檢測(cè)（450 nm/630 nm校正孔間誤差）。

六、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

高背景噪音：增加洗滌次數(shù)（5次以上），檢查封閉液是否失效。

低信號(hào)值：優(yōu)化包被濃度或延長(zhǎng)底物孵育時(shí)間。

孔間差異大：使用多通道移液器，確保加樣一致性。