畢赤酵母，甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為碳源和能源的酵母菌。巴斯德畢赤酵母，是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無(wú)性生長(zhǎng)期主要以單倍體形式存在，當(dāng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)限制時(shí)，常誘導(dǎo)2個(gè)生理類型不同的接合型單倍體細(xì)胞交配，融合成雙倍體。

一、研究介紹

巴斯德畢赤酵母的另一個(gè)生物學(xué)特點(diǎn)是，甲醇代謝所需的醇氧化酶被分選到過氧化物酶體中，形成區(qū)域化。以葡萄糖作碳源時(shí)，菌體中只有1個(gè)或很少幾個(gè)小的過氧化物酶體，而以甲醇作碳源時(shí)，過氧化物酶體幾乎占到整個(gè)細(xì)胞體積的80%，AOX增至細(xì)胞總蛋白的35%-40%。因此，當(dāng)在AOX基因前利用同源重組方式插入外源蛋白基因時(shí)，可獲得大量表達(dá)。同時(shí)，根據(jù)甲醇酵母這種可以形成過氧化物酶體的特性，既可利用該系統(tǒng)表達(dá)一些毒性蛋白和易被降解的酶類，也可用以研究細(xì)胞特異區(qū)域化的生物發(fā)生及其機(jī)制和功能，為高等動(dòng)物類似的研究提供啟示。

二、開發(fā)利用

Koichi Ogata等人于1969年發(fā)現(xiàn)了某些酵母可以利用甲醇為碳源和能源生長(zhǎng)(Ogata, et a1.1969 )，此后，用甲醇利用型酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白作為動(dòng)物飼料的潛力就引起了廣泛關(guān)注。1987年，Cregg等人報(bào)道了用甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HbsAg隨后Philip Petroleum公司與Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)就開始了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的合作開發(fā)。SIBIA.的研究人員分離了AOX基因的啟動(dòng)子和宿主菌株，構(gòu)建了載體，并開發(fā)出了相應(yīng)的畢赤酵母基因操作技術(shù)，結(jié)合Philip Petroleum公司生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了外源蛋白的高效表達(dá)。1993年，Philip Petroleum公司將畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的賣給Research Corporation Technologies公司，并委托Invitrogea公司進(jìn)行有關(guān)產(chǎn)品銷售。

三、優(yōu)缺點(diǎn)

Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。包括啟動(dòng)子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌胞外，表達(dá)載體還需帶有信號(hào)肽序列。

四、甲型優(yōu)點(diǎn)

(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子，這是目前，調(diào)控機(jī)理的啟動(dòng)子之一；

(2)表達(dá)效率高,其表達(dá)的外源蛋白可占總表達(dá)蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分離純化；

(3)在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基中可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)；

(4)表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合；

(5)由于該酵母可以以甲醇為碳源和能源,而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源,可以減少污染。

五、甲型不足

(1)發(fā)酵周期長(zhǎng)；

(2)甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危險(xiǎn)性；

(3)篩選高產(chǎn)菌株需用的藥物價(jià)格比較昂貴；

(4)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不成熟。

六、生產(chǎn)過程

（1）細(xì)胞增殖繁衍；

（2）分批流加的過渡階段（甘油或葡萄糖）；

（3）誘導(dǎo)表達(dá)階段（甲醇）；

各階段碳源都為限制性基質(zhì),其補(bǔ)加速率的動(dòng)力學(xué)模型是高效表達(dá)的基礎(chǔ)。

七、常用載體

典型的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體載體包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點(diǎn)（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標(biāo)記及3'AOX1區(qū)。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體時(shí)，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個(gè)載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動(dòng)子控制下表達(dá)。畢赤酵母本身不分泌內(nèi)源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號(hào)序列。

而由89個(gè)氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號(hào)—α交配因子(α-factor)引導(dǎo)序列已經(jīng)成功地引導(dǎo)了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達(dá)載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞內(nèi)表達(dá)載體主要有：pHIL-D2，pAO815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115菌株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點(diǎn)被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。

八、多拷貝

與復(fù)制的質(zhì)粒型表達(dá)載體不同，整合型表達(dá)載體的拷貝數(shù)可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達(dá)菌株合成蛋白的量也較多。體內(nèi)整合可通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。多拷貝表達(dá)菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDS-PAGE電泳、免疫雜交或菌落點(diǎn)雜交方法在大量的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)行自然篩選。得到產(chǎn)量高的表達(dá)菌株。另一種在轉(zhuǎn)化前將多個(gè)表達(dá)盒拷貝插入到單個(gè)載體中，而后再通過交換整合到受體染色體上。

九、純化方法

酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般都具有活性，所以都采用較溫和的純化方式來(lái)純化目的蛋白，分泌型表達(dá)的蛋白有利于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進(jìn)一步純化。具體的方法和操作應(yīng)按所處理的目的蛋白的性質(zhì)選擇。

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