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禽流感的實(shí)驗(yàn)室診斷

來(lái)源:上海寶葉生物科技有限公司   2012年10月19日 08:37  

由A型流感病毒引起的禽流感,其臨床癥狀因感染禽的年齡、種類(lèi)、飼養(yǎng)管理水平、并發(fā)感染情況及新感染毒株的毒力等不同而表現(xiàn)不一致。其病理變化因感染病毒株毒力的高低、病程的長(zhǎng)短及種類(lèi)不同也不盡相同。因此,禽流感的診斷一直依賴(lài)于病原的分離鑒定,OIE也一直采取的是進(jìn)行病毒分離鑒定這個(gè)黃金標(biāo)準(zhǔn)。隨著血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展,禽流感診斷技術(shù)的研究也取得了新的進(jìn)展。

    對(duì)于禽流感傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法是用雞胚或者狗腎細(xì)胞(MDCK)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)等進(jìn)行病毒分離,采用血凝和血凝抑制進(jìn)行鑒定,血清學(xué)的診斷方法則包括中和試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。近年來(lái),隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,禽流感的診斷技術(shù)也越來(lái)越完善,現(xiàn)在已經(jīng)有免疫印跡、免疫熒光、ELISA、墓因芯片、RT-PCR技術(shù)、熒光RT-PCR技術(shù)、NASBA技術(shù)等。
如果要檢驗(yàn)是否是高致病性禽流感病毒,在進(jìn)行HA亞型鑒定之后,還需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物試驗(yàn)或進(jìn)行裂解位點(diǎn)的序列分析等進(jìn)行判斷。因?yàn)镺IE判斷HPAIV的標(biāo)準(zhǔn)是:①含流感病毒尿囊液,做l:10稀釋?zhuān)o脈內(nèi)接種8只4~8周齡易感雞,每只0.2ml,如在10天內(nèi)死亡6只以上,則該流感病毒為HPAIV~②如果致死l一5只易感雞,而且又不是H5或H7亞型,則將其接種雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)或MDCK細(xì)胞,在沒(méi)有胰酶的情況下觀(guān)察是否產(chǎn)生細(xì)胞病理變化,如不產(chǎn)生病理變化,該流感病毒就不是HPAIV;③對(duì)于所有的低致病性H5和H7亞型病毒和其他流感病毒,如果在沒(méi)有胰酶的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)能生長(zhǎng),則必須測(cè)定血凝素裂解部位的氨基酸順序,如果相似于其他的HPAIV,存在多個(gè)堿性氨基酸序列,則該受檢病毒被視為高致病性。
 
    1.樣品采集
    樣品采集的質(zhì)量是進(jìn)行禽流感檢測(cè)的關(guān)鍵。應(yīng)從死禽和處于急性發(fā)病期的病禽采集樣品,樣品要具有典型性。采樣過(guò)程要注意無(wú)菌操作,同時(shí)避免污染環(huán)境。采樣人員要按NY/丁7(38要求加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)。樣品的保存和運(yùn)輸也要按照有關(guān)的規(guī)定和要求進(jìn)行。
    (1)病料樣品  至少?gòu)?只病禽和病死禽中采集病料樣品(發(fā)病群不足5只則全部采樣)。樣品應(yīng)包括:泄殖腔(新鮮糞尿樣)棉拭子和氣管棉拭子(置于緩沖液中);氣管和肺的混樣;腸管及內(nèi)容物的混樣;肝、脾、腎和腦等其他組織樣品(不能混樣)。
    組織樣品、氣管棉拭子單獨(dú)放人容器,容器中盛放含有抗生素(pH值為7.0~7.4)的PBS液??股氐倪x擇應(yīng)視當(dāng)?shù)厍闆r而定,組織和氣管拭子懸液中加入青霉素(20001U/ml)、鏈霉素(2mg/ml)或慶大霉素(50t~g/m1)。腸管及內(nèi)容物、糞便樣品和泄殖腔棉拭子所用的抗生素濃度應(yīng)提高5倍(加入抗生素后PBS液的pH值應(yīng)調(diào)至7.0-7.4)。
(2)血樣  分別采集至少10個(gè)病禽的(急性發(fā)病期血清,如發(fā)病群不足10只則全部采樣),并要求單獨(dú)存放,不能混合。
 
    2.病毒的分離鑒定
    以無(wú)菌拭子采集氣管或泄殖腔病料或病變組織,研磨制成10%懸液,經(jīng)處理后接種9-11日齡SPF雞胚,收獲尿囊液測(cè)定血凝活性,若為陰性則應(yīng)繼續(xù)盲傳2~3代。對(duì)具有血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清做HI試驗(yàn),以排除新城疫的可能,即使ND陽(yáng)性也應(yīng)采用中和法繼續(xù)傳代,看是否為ND與AIV混合感染。然后用免疫擴(kuò)散等方法來(lái)檢測(cè)特異性核心抗原NP或MP,然后用血凝抑制試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時(shí),進(jìn)行致病力試驗(yàn),確定毒力的強(qiáng)弱。
    雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)  雞胚的組織分化程度低,可選擇適當(dāng)途徑接種,病毒易復(fù)制,感染病毒的膜和液體含大量病毒;雞胚是個(gè)整體,有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造;來(lái)源充足,操作簡(jiǎn)單,通常是無(wú)菌的,對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。3天可報(bào)告結(jié)果。病毒分離鑒定對(duì)AI的診斷比較確實(shí),但操作程序繁雜,費(fèi)用高,耗時(shí)費(fèi)力。

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