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（一）抗原抗體反應
根據(jù)RIA原理，將未標記抗原（標準品和待測樣品）、標記抗原和特異性抗體加入反應試管中，在一定條件（溫度、時間及介質(zhì)pH）下進行競爭抑制反應；為取得*實驗效果（如靈敏度及檢測濃度范圍），上述三種主要試劑可同時反應（平衡法），也可采用非平衡法，先加待測樣品（或標準品）和抗血清，使非標記抗原與抗體達到結合平衡，然后再加入標記抗原競爭與抗體結合。此外，反應溫度和時間可依據(jù)具體待檢抗原的特性和所用抗體親和力（K值）大小等條件進行選擇。若抗原性質(zhì)穩(wěn)定且含量高，反應時間可較短（數(shù)小時），反應溫度可選室溫或37℃；若抗原的理化性質(zhì)不穩(wěn)定（如某些小分子肽）或含量甚微、或抗體的K值較低，則應選低溫（4℃）長時間（20～24h）反應條件。
劑量-反應（競爭—抑制）曲線圖
（二）分離結合與游離標記物
RIA反應平衡后，標記抗原與試劑抗體形成免疫復合物（B）。由于其含量極少，不能自行沉淀，因此需加入適當?shù)某恋韯┎拍軐⑵?沉淀，然后經(jīng)離心使其與游離的標記抗原（F）分離。某些小分子抗原，也可采用吸附法分離B與F。
B、F分離步驟所造成的誤差是RIA實驗誤差的重要組成部分，可影響方法的靈敏度和測定的準確性。理想的分離方法應分離*，迅速；分離試劑和過程不影響反應平衡，而且效果不受反應介質(zhì)因素的影響；操作應簡單、重復性好以及經(jīng)濟。
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