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牛奶中β-內(nèi)酰胺酶檢測方法-----液相色譜法檢測無抗奶
“無抗奶”，顧名思義，即不含抗生素的牛奶。早在2002年，這一概念便被提出，“無抗生素”的字樣也登上了乳品包裝。
為何牛奶含抗生素？
牛奶中的抗生素來自乳牛，乳牛被注射抗生素，主要是治療乳腺發(fā)炎。乳腺炎是奶牛常見病，抗生素的使用是業(yè)內(nèi)“公開的秘密”。牛奶中的抗生素可能導(dǎo)致飲用者過敏，或因長期接觸抗生素而耐藥。
如何做到“無抗”？
藥品合理間隔期后才擠奶，可以生產(chǎn)無抗奶，可以通過檢驗抗生素的方式驗證。
1、間接法
方法原理：利用β-內(nèi)酰胺酶能夠酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定濃度的β-內(nèi)酰胺酶，那么青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度會減少，從而判斷牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶。
實(shí)驗步驟：稱取20 g試樣，在4℃、16000rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，并將塑料離心管置于37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。向孵育后的離心管中加入無水乙醇15 mL。振蕩提取30 min后離心，將上層清液過濾紙后收集于梨形瓶中。減壓濃縮蒸發(fā)掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH=8.5），渦旋1 min后調(diào)節(jié)pH為8.5。以1 mL/min的速度將提取液通過經(jīng)過預(yù)處理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸緩沖液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。zui后用3 mL乙腈洗脫。將洗脫液在40℃下氮?dú)獯蹈?，?/span>0.025 M磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）定容殘渣至1 mL,待上機(jī)測定。
色譜條件：LabAlliance PC-2000液相色譜配2000型紫外檢測器；
1、間接法
方法原理：利用β-內(nèi)酰胺酶能夠酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定濃度的β-內(nèi)酰胺酶，那么青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度會減少，從而判斷牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶。
實(shí)驗步驟：稱取20 g試樣，在4℃、16000rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，并將塑料離心管置于37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。向孵育后的離心管中加入無水乙醇15 mL。振蕩提取30 min后離心，將上層清液過濾紙后收集于梨形瓶中。減壓濃縮蒸發(fā)掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH=8.5），渦旋1 min后調(diào)節(jié)pH為8.5。以1 mL/min的速度將提取液通過經(jīng)過預(yù)處理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸緩沖液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。zui后用3 mL乙腈洗脫。將洗脫液在40℃下氮?dú)獯蹈?，?/span>0.025 M磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）定容殘渣至1 mL,待上機(jī)測定。
色譜條件：LabAlliance PC-2000液相色譜配2000型紫外檢測器；
lanbo色譜柱 :C18（4.6mm×150mm×5μm）；
流動相: 甲醇/0.004M 磷酸二氫鉀（pH=4.5）＝40/60；
檢測波長: 268 nm
2、直接法
方法原理：牛乳中的青霉素鉀在β-內(nèi)酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸鉀，并伴隨生成少量的青霉胺、青霉醛等物質(zhì)。經(jīng)去脂肪、蛋白等前處理后，可以將青霉噻唑酸鉀提取出來，經(jīng)液相色譜儀檢測確認(rèn)其是否存在，從而判定該牛乳是否為人造“無抗奶”。
實(shí)驗步驟：稱取20 g試樣，在4 ℃、16000 rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，加入無水乙醇15 mL，振蕩提取30 min后離心，取清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，用液相色譜儀檢測。
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取0.01 g（至0.001 g）青霉素鉀于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解劑，室溫放置2h使青霉素鉀酶解*后用去離子水定容，得到青霉噻唑酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度100 μg/mL。根據(jù)實(shí)際情況稀釋后使用。
色譜條件：LabAlliance PC-2000液相色譜配2000型紫外檢測器；
流動相: 甲醇/0.004M 磷酸二氫鉀（pH=4.5）＝40/60；
檢測波長: 268 nm
2、直接法
方法原理：牛乳中的青霉素鉀在β-內(nèi)酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸鉀，并伴隨生成少量的青霉胺、青霉醛等物質(zhì)。經(jīng)去脂肪、蛋白等前處理后，可以將青霉噻唑酸鉀提取出來，經(jīng)液相色譜儀檢測確認(rèn)其是否存在，從而判定該牛乳是否為人造“無抗奶”。
實(shí)驗步驟：稱取20 g試樣，在4 ℃、16000 rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，加入無水乙醇15 mL，振蕩提取30 min后離心，取清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，用液相色譜儀檢測。
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取0.01 g（至0.001 g）青霉素鉀于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解劑，室溫放置2h使青霉素鉀酶解*后用去離子水定容，得到青霉噻唑酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度100 μg/mL。根據(jù)實(shí)際情況稀釋后使用。
色譜條件：LabAlliance PC-2000液相色譜配2000型紫外檢測器；
lanbo色譜柱 :C18（4.6mm×150mm×5μm）；
流動相: 甲醇/0.004 M磷酸二氫鉀（pH=4.5）＝40/60；
檢測波長: 230 nm
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