Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品簡介：

細胞凋亡是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。

用標(biāo)記了FITC的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜與細胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。將AnnexinⅤ與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+ /PI+ ）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+ /PI-）。

產(chǎn)品組成：

使用方法：

1.       離心收集懸浮細胞，微量離心機轉(zhuǎn)速2000RPM，離心時間5min，棄培養(yǎng)基。

2.     用冷PBS洗滌細胞兩次。

3.     用400ul 1X Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1 X 10⁶ cells/ml。

4.     在細胞懸浮液中加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。

5.     加入10ul PI后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育5分鐘。

6.     在1小時內(nèi)用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

流式細胞儀分析：

經(jīng)處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。激發(fā)波長為488nm。

按照常規(guī)的流式凋亡檢測的操作即可。 Annexin V-FITC的綠色熒光通過FL1通道檢測；PI紅色熒光通過FL2或FL3通道檢測，建議使用FL3。

可以參考下面的流式設(shè)置：

使用流式細胞儀正確分析Annexin V-FITC/PI雙染的細胞前要求儀器的熒光補償來去除兩種染料激發(fā)光之間的疊加。因為熒光補償設(shè)置與PMT的電壓直接相關(guān)，所以不同儀器之間的補償不同。建議在實驗開始階段分析經(jīng)Annexin V、PI分別單染的細胞來調(diào)整熒光補償去除光譜重疊。根據(jù)未處理細胞空白對照和經(jīng)Annexin V、PI分別細胞染色后的單染對照的分析設(shè)定十字門的位置。

1.      上樣未經(jīng)染色的細胞，在線性FS-SS點圖上顯示細胞并設(shè)門圈出目標(biāo)細胞群體。

2.      建立LogFL1-LogFL2（用FL3）雙參數(shù)點圖并分析以上光散射圖中設(shè)門的細胞；保證>98%的細胞處于在X、Y軸Log 1為邊界的左下象限中心區(qū)域。

3.      檢測annexin V-FITC單染的細胞并檢查FL1-FL2（或FL3）散點圖，保證在左上和右上象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在上端象限則說明有熒光滲漏；此時FL1的熒光被FL2 （或FL3）PMT檢測到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL1漏到FL2（或FL3）熒光的補償%（這可能在1-5%之間）。如果這個調(diào)節(jié)沒有有效地去除FL2的陽性信號，此時要降低FL2（或FL3） PMT的電壓。

4.      檢測PI單染的細胞并檢查FL1-FL2（或FL3）散點圖，保證在右上和右下象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在右側(cè)象限則說明有熒光滲漏；此時PI的熒光被FL1 PMT檢測到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL2（或FL3）漏到FL1熒光的補償%（這可能在15-25%之間）。如果這個調(diào)節(jié)沒有有效地去除FL1的陽性信號，此時要降低FL1 PMT的電壓。

     注：如果在以上調(diào)節(jié)補償過程中更改了PMT的電壓，建議重復(fù)3、4步驟，確保不引起過度熒光補償。過度補償可以從陽性細胞十分貼近從標(biāo)這一現(xiàn)象觀察出來。一個恰當(dāng)?shù)难a償應(yīng)該是單陽性細胞熒光強度與落在左下Log 1為邊界象限中間陰性細胞的熒光強度一致。

5.     設(shè)定十字門的位置，F(xiàn)L1和FL2（或FL3）的劃定方法如下：

5.1 設(shè)定FL1標(biāo)尺位置: 處于左下象限內(nèi)的大群細胞是Annexin V染色陰性的細胞（一般這些細胞會在FL1軸方向上升至2個對數(shù)坐標(biāo)值）。將垂直的FL1標(biāo)尺設(shè)定在緊靠Annexin V陰性群體右側(cè)0.1-0.2Log單位的地方。

5.2 設(shè)定FL2 （或FL3）標(biāo)尺位置: 可以通過一定數(shù)據(jù)的雙陽性細胞來區(qū)分PI+和PI-的細胞群體。在此條件下可能會識別出兩群細胞，一是位于散點圖的右下方（ANN+/PI-）還有就是右上方（ANN+/PI+）。水平線可以置于這兩群細胞的中間。如果在分析的細胞群體中沒有PI+細胞，區(qū)分PI+細胞是參照雙陰性細胞群體，將水平線設(shè)在雙陰性細胞以上0.1-0.3 Log單位的地方。

注：在陰性群體門以外的細胞可被識為Annexin V或Annexin V和PI陽性的細胞。

熒光顯微鏡觀察：

1.     滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。

注：對于貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細胞并誘導(dǎo)細胞凋亡。

2.     在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

儲存條件：

2-8℃保存。

有效期：

一年。

注意事項：

1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

2.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。

4.成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類型、細胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時PS翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時間等，把這些影響因素進行優(yōu)化對實驗成功與否至關(guān)重要。

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