[預(yù)期應(yīng)用]

本試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清 或其它相關(guān)生物液體中IL8含量。

[試劑盒內(nèi)容]

[需自備的設(shè)備及試劑]

1、450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2、單道或多道微量加液器及吸頭

3、稀釋樣品的EP管

4、蒸餾水或去離子水

5、吸水紙

6、盛放洗液的容器

[操作步驟]

1、 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn)試劑準(zhǔn)備2）。空白孔加100μL（見(jiàn)試劑準(zhǔn)備第二步zui后一管），余孔加待測(cè)樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC溫育2小時(shí)。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3、 每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μL（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC溫育1小時(shí)。

4、 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干），重復(fù)洗板3次。zui后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。自動(dòng)洗板機(jī)亦可。

5、 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100μL，加上覆膜，37^oC溫育30分鐘。

6、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-25分鐘，不要超過(guò)30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。

8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

9、 在確保酶標(biāo)板底無(wú)水滴及孔內(nèi)無(wú)氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（O.D.值）。

注意：

1、 試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō)明書(shū)要求保存，以備下次使用。

2、 加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗(yàn)過(guò)程中。

5、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘觀察一次），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6、 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7、 如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。

[實(shí)驗(yàn)原理]

將IL8抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的IL8與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的IL8抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記的親和素，再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL8呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。

[計(jì)算]

各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（或?qū)?shù)坐標(biāo)），O.D.值為橫坐標(biāo)（或?qū)?shù)坐標(biāo)），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（*方程式應(yīng)依回歸方程計(jì)算的R²值來(lái)定，以R²值越趨近于1為好）。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.30，根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的       O.D.值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

[檢測(cè)范圍]

15.6pg/mL-1,000pg/mL

[zui低檢測(cè)限]

6.4pg/mL

此值為20個(gè)空白樣品（即標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）測(cè)定的平均值加二倍標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的濃度。

[穩(wěn)定性]

經(jīng)測(cè)定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

試劑盒穩(wěn)定性由加速破壞試驗(yàn)測(cè)定。具體方法為：將試劑盒放置于37^oC破壞3天后重新測(cè)定其各項(xiàng)指標(biāo)，并比較破壞前后的測(cè)定值。（參考《中國(guó)生物制品規(guī)程》，生物試劑在37^oC每穩(wěn)定一天，相當(dāng)于4^oC保存2個(gè)月）。

注意：

為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來(lái)進(jìn)行操作可減少人為誤差。

[實(shí)驗(yàn)流程]

1、實(shí)驗(yàn)前標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本的準(zhǔn)備；

2、加樣（標(biāo)準(zhǔn)品及樣本）100μL，37^oC孵育2小時(shí)；

3、加檢測(cè)溶液A100μL，37^oC孵育1小時(shí)；

4、洗板3次；

5、加檢測(cè)溶液B100μL，37^oC孵育30分鐘；

6、洗板5次；

7、加TMB底物90μL，37^oC孵育15－25分鐘；

8、加終止液50μL，立即450nm讀數(shù)。

[說(shuō)明]

1、 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

2、 zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

3、 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考。

4、 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到*的檢測(cè)結(jié)果。

5、 在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

6、 剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。請(qǐng)勿提前將酶標(biāo)板從包裝袋里拿出。

7、 由于操作者不熟練、操作失誤或讀數(shù)儀程序選用錯(cuò)誤等有可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的產(chǎn)生。請(qǐng)使用者使用該產(chǎn)品前仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，調(diào)試好酶標(biāo)儀，請(qǐng)使用配備有450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀，且該酶標(biāo)儀測(cè)量范圍在0.001-3.000 O.D.或以上。

對(duì)ELISA操作不熟悉的可以參照視頻

8、 同一使用者在使用同一產(chǎn)品時(shí)，如不同時(shí)間訂購(gòu)，也可能會(huì)因不同批次的少量差異產(chǎn)生不同結(jié)果，因此建議使用者在每次使用前均進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

9、 試劑盒在出廠前均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)，但由于運(yùn)輸條件及各實(shí)驗(yàn)室條件差異，可能會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與出廠結(jié)果不一致或不同批次試劑盒批間差大的情況，Uscn,Inc.會(huì)根據(jù)實(shí)際情況酌情處理。

10、本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測(cè)同一目的蛋白的產(chǎn)品做對(duì)比，平行檢測(cè)可能會(huì)存在檢測(cè)結(jié)果不一致的情況。

11、本試劑盒有效期：六個(gè)月。

12、本操作說(shuō)明同樣適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。

[警告]

本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。