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一、生物大分子色譜純化方法的選擇思路
通常在做純化前對(duì)自己的目標(biāo)物質(zhì)特性了解越多對(duì)純化將會(huì)越有利，如果不太了解，也可以通過電泳知道目標(biāo)物質(zhì)和雜質(zhì)的情況，找到一種簡單的鑒定方法，此外在純化前必須先建立可靠的活性測定的方法。如果是未知的蛋白，那么通?？梢杂袔追N簡單的摸索：
1.凝膠過濾色譜。這個(gè)方法很常用，但是效率不高，對(duì)低濃度的樣品沒有富集作用，上樣量小。
2.離子交換色譜。此法很常用，但是樣品必須沒有高濃度的鹽。
3.疏水色譜。此法較好，它分離效率高，上樣量大，特別適合分離鹽析沉淀的樣品。
4.親和色譜。是zui有效的手段，關(guān)鍵了解目標(biāo)物質(zhì)的特性以便選擇合適的親和色譜填料。
二、主要用途介紹
1.去除內(nèi)毒素
內(nèi)毒素也叫熱源，一般是磷脂A ，糖類和蛋白，在中性條件下帶有負(fù)電荷。內(nèi)毒素的磷脂部分有很強(qiáng)的疏水性，一般的在高鹽情況下它們會(huì)聚合，所以不能用疏水色譜，如果蛋白本身的疏水性強(qiáng)，可以選擇把目標(biāo)蛋白結(jié)合到疏水色譜填料(苯基瓊脂糖凝膠FF ，丁基瓊脂糖凝膠FF )上和內(nèi)毒素分離。
內(nèi)毒素因?yàn)閹в泻軓?qiáng)負(fù)電荷，如果目標(biāo)蛋白帶陽電荷，用DEAE 瓊脂糖凝膠FF 或Q 瓊脂糖凝膠FF 把內(nèi)毒素吸附，達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的。如果目標(biāo)蛋白帶陰電荷，可以嘗試用階段或梯度洗脫的方法把它們分離。
其中zui有效而特異的方法是用親和色譜填料去除內(nèi)毒素，為此專門開發(fā)了兩種專門去除內(nèi)毒素的色譜填料，去內(nèi)毒素瓊脂糖凝膠FF 和去內(nèi)毒素瓊脂糖凝膠FF 可以很方便去除內(nèi)毒素，其應(yīng)用簡單，效果明顯，樣品回收率高。方法是把適量的色譜填料加到樣品中4 度震蕩40h 左右無菌過濾就可以得到熱源符合要求的樣品，或者直接裝柱然后循環(huán)上樣8 小時(shí)左右即可。
2.去除核酸
大量的核酸會(huì)使樣品的粘度增加，影響傳質(zhì)從而影響分離效果，此外在藥品檢驗(yàn)中也對(duì)核酸的含量有嚴(yán)格的規(guī)定，所以去除核酸非常重要。
核酸帶有陰性的電荷，可用陰離子交換色譜填料DEAE 瓊脂糖凝膠FF 或Q 瓊脂糖凝膠FF 去除，也可用陽離子色譜填料： SP 瓊脂糖凝膠FF 或CM 瓊脂糖凝膠FF 直接把目標(biāo)蛋白吸附而去除核酸。在2M 硫酸銨的條件下，RNA 和DNA 都可以被苯基瓊脂糖凝膠FF 吸附。
此外也可以用核酸酶處理樣品，把核酸降解成小片段，用凝膠過濾就可以去除。此外也可以本公司的DNA 純化瓊脂糖凝膠FF 去除。
3.純化硫酸銨沉淀樣品
硫酸銨沉淀是很常用的初分離的手段，這樣沉淀后的樣品可直接用苯基瓊脂糖凝膠FF 或者是丁基瓊脂糖凝膠FF 分離，不用除鹽，非常方便。疏水色譜已經(jīng)得到大規(guī)模的推廣和應(yīng)用，是很好的純化的手段。此外疏水色譜也可以用于天然產(chǎn)物的分離純化，包括多肽、色素等各種物質(zhì)的分離純化，它的分離原理和反相色譜相同，但是不同于硅膠色譜填料的是它對(duì)樣品幾乎沒有死吸附，所以回收率高。
4.糖蛋白的純化
偶聯(lián)各種凝集素的瓊脂糖凝膠FF 的親和色譜填料可以分離各種糖蛋白，例如Con A 瓊脂糖凝膠FF 可以純化糖基化的蛋白，或者膜組分，甚至細(xì)胞等物質(zhì)。此外硼酸瓊脂糖凝膠FF 也用來分離各種多糖和糖蛋白，其原理是苯硼酸類似于凝集素可以和各種糖基上的鄰二羥基發(fā)生親和作用。
5.膜蛋白分離
有比較強(qiáng)的疏水性，可以用苯基或丁基瓊脂糖凝膠FF 疏水色譜分離，如果是有糖基結(jié)構(gòu)或者受體等，也可以用親和色譜的方法。
6.純化抗體和抗原
蛋白A 瓊脂糖凝膠FF 可以用于分離純化各種來源的抗體，包括抗血清、培養(yǎng)液以及腹水等樣品。蛋白A 可以特異吸附IgG 的Fc 區(qū)，所以它也適合分離酶解后的Fc 片段，把Fab 片段和Fc 段分離。同時(shí)蛋白A 瓊脂糖凝膠FF 也可用于血清中IgG 的分離，得到不含抗體的血清，蛋白A 瓊脂糖凝膠FF 有很好的穩(wěn)定性，能耐受37 度3-5 天而對(duì)柱子的性能沒有影響，是分離抗體的*選擇。
疏水色譜色譜填料苯基瓊脂糖凝膠FF 以及DEAE 瓊脂糖凝膠FF 也場用于抗體的分離，只是特異性不如重組蛋白A 瓊脂糖凝膠FF 好。
純化IgG 抗原zui有效的辦法是免疫親和，具體的方法是把抗抗原的IgG 直接偶聯(lián)到環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠FF 上，然后直接高pH 吸附，低pH 洗脫就可以得到需要的抗原。
對(duì)于高親和力的抗體篩選，特別是小分子的半抗原，我們建議可以把半抗原偶聯(lián)到環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠FF ，把只和抗原結(jié)合的IgG 分離，得到高親和力的抗體，非常方便和實(shí)用，此外也可以選擇氨基化瓊脂糖凝膠FF 或羧基化化瓊脂糖凝膠FF 偶聯(lián)半抗原，特別是對(duì)那些不適合用環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠FF 偶聯(lián)的半抗原。如果要偶聯(lián)的是小分子的物質(zhì)，需要用11 個(gè)碳原子親和手臂的活化好的填料，這樣才能克服空間位阻得到*分離效果，如果是大分子的物質(zhì)，那用3 個(gè)碳原子親和手臂的活化好填料就可以，這樣栽量高，效果好。
IgM 和IgY 可用吡啶瓊脂糖凝膠FF 親和的方法把它們和雜蛋白分離。
7.純化重組蛋白
重組蛋白構(gòu)建已經(jīng)考慮到純化的問題，大大簡化了純化的步驟，但還是會(huì)遇到些實(shí)際的問題，所以需要詳細(xì)閱讀使用說明和注意事項(xiàng)。
(一)HIS 標(biāo)簽重組蛋白可以很方便用鎳瓊脂糖凝膠FF 分離，色譜填料已經(jīng)螯合好了鎳離子，使用非常方便，吸附載量更高，特異性更強(qiáng)，可以選擇多種洗脫方式，是純化這類融合蛋白的*工具。
(二)ST 融合蛋白在表達(dá)時(shí)同時(shí)表達(dá)了谷胱甘肽s 轉(zhuǎn)酶，很方便用GST 瓊脂糖凝膠FF 分離，然后再用腸激酶或凝血酶等酶解就得到表達(dá)的產(chǎn)物。而凝血酶可以用肝素瓊脂糖凝膠FF 或苯甲脒瓊脂糖凝膠FF 分離。
(三)白A 融合蛋白可以用IgG 瓊脂糖凝膠FF 分離。
(四)涵體蛋白的色譜復(fù)性: 離子交換和疏水色譜都在包涵體復(fù)性中有很好的效果，金屬螯合色譜填料等親和色譜填料也常用于帶HIS 標(biāo)簽融合蛋白的色譜復(fù)性。
8.疫苗的純化
疫苗可以用瓊脂糖凝膠FF
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