建立化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測(cè)禽肉中氯霉素的殘留

王文珺， 陳銀輝1，王立淼2，邢佑尚1，王照鵬1，江海洋2

（1. 北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京，100095；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京，100193）

摘要：本研究的目的是建立檢測(cè)禽肉中氯霉素殘留的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法（CLEIA）；通過方陣法確定包被抗體及酶標(biāo)抗原的濃度，對(duì)體系優(yōu)化后，建立了氯霉素直接競(jìng)爭(zhēng)性CLEIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用CLEIA與液質(zhì)聯(lián)用（LC/MS） 檢測(cè)禽肉中氯霉素的含量。結(jié)果表明，本研究建立的檢測(cè)禽肉中氯霉素殘留的CLEIA法，檢測(cè)限為15pg/g，CLEIA法的回收率為74.7%-107.8%，變異系數(shù)為4.5%-11.5%，CLEIA和LC/MS兩種方法分析結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。

關(guān)鍵詞：氯霉素；化學(xué)發(fā)光酶免疫分析；禽肉；液質(zhì)聯(lián)用

 Development of a Chemiluminescence Enzyme Immunoassay for the Determination of Chloramphenicol in Poultry 

WANG Wenjun1, CHEN Yinhui1, WANG Limiao2, XING Youshang1, 

WANG Zhaopeng1, JIANG Haiyang2

（1.Beijing WDWK Biotechnology Co, Ltd, Beijing 100095；2. college of Veterinary Medicine，China Agricultural University, Beijing 100193）

Abstract：The aim of this work was development a chemiluminescence Enzyme Immunoassay (CLEIA) for the determination of chloramphenicol in poultry. The concentrations of coating antibody and HRP labeled antigen of CLEIA for chloramphenicol were determinated with chessboard format and the standard curves of chloramphenicol were established．Poultry samples were spiked with chloramphenicol and the concentrations were detected with both CLEIA and LC/MS methods．The results showed that the detection limit of CLEIA was 15 pg/g for poultry； The recoveries of CLEIA were 74.7％-107.8％ and coefficients of variability were 4.5%- 11.5%．There were no distinct difference between the results of CLEIA and LC/MS（P＞0.05）, which showed CLEIA can be used for the detection of chloramphenicol in poultry.

Key words: Chloramphenicol (CAP)；Chemiluminescence Enzyme Immunoassay (CLEIA)；Poultry；LC/MS

氯霉素（CAP）屬抑菌性廣譜抗生素，zui初是從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取制得，現(xiàn)在可用化學(xué)方法大量生產(chǎn)。氯霉素（結(jié)構(gòu)式見圖1）的結(jié)構(gòu)與5′-磷酸尿嘧啶類似，所以它通過阻止細(xì)胞內(nèi)氨基酞tRNA與核糖體50S亞基A位點(diǎn)的結(jié)合，從而阻撓蛋白質(zhì)的合成。氯霉素曾被廣泛應(yīng)用于我國(guó)的畜牧業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)畜禽的疾病控制和治療起到了重要作用。但后來人們研究發(fā)現(xiàn)：氯霉素對(duì)人的造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)具有嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，可引發(fā)人的再生障礙性貧血；同時(shí)還會(huì)引起視神經(jīng)炎和皮疹等不良反應(yīng)[1]。因此氯霉素只在對(duì)其他抗生素耐藥或不得不使用的嚴(yán)重病例中選用。目前，世界許多國(guó)家禁止在食用性動(dòng)物使用氯霉素，歐盟、美國(guó)等國(guó)家均在法規(guī)中規(guī)定氯霉素殘留*為“零容許量”，即不得檢出。2002年，*235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥zui高殘留*》規(guī)定氯霉素及其鹽、酯禁止用于任何食品動(dòng)物，所有可食性組織不得檢出。然而由于氯霉素的抑菌效果好，價(jià)格低廉，仍有被一些國(guó)家或動(dòng)物食品生產(chǎn)商使用。對(duì)高密度、工廠化的家禽養(yǎng)殖業(yè)來說，氯霉素往往被用做藥物添加劑，以避免動(dòng)物高發(fā)病率情況的出現(xiàn)，所以時(shí)有禽肉中氯霉素超標(biāo)的報(bào)道。

氯霉素殘留方法的建立始于上世紀(jì)七十年代，到目前為止，已相繼建立起了氣相色譜、液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用及酶聯(lián)免疫及化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)方法[2-5]。北京維德維康生物技術(shù)有限公司推出的氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，從檢測(cè)限、靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度等都達(dá)到了同行業(yè)水平。在該研究的基礎(chǔ)上，我們又推出了化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，使得檢測(cè)方法更為簡(jiǎn)單、靈敏和快速，便于實(shí)現(xiàn)對(duì)禽肉中氯霉素殘留的篩查。

                                圖1  氯霉素結(jié)構(gòu)式

1.材料與方法

• 試劑與材料

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、明膠、ProClin 300購(gòu)自Sigma公司；氯霉素酶標(biāo)抗原（北京維德維康生物技術(shù)有限公司自制）；化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，丹麥Nunc公司；乙酸乙酯、正己烷等試劑均購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)。

   CLEIA所用的緩沖溶液：

（1）包被緩沖液: 碳酸鹽緩沖液0.05mol/L，pH 9.6；

（2）0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）：PB緩沖液中加入0.15 mol/L NaC1，pH 7.2；

（3）洗滌液：1000 mL PBS加1 mL Tween-20；

• 酶稀緩沖液：1000 mL PBS加1 mL Tween-20、1 g明膠和300 μL ProClin 300；

（5）封閉液：1000 mL PBS加入5 g明膠和300 μL ProClin 300。

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