所有的分子生物學(xué)家都會告訴你：將DNA段片克隆到載體中去是一件棘手的事情。研究人員要查看復(fù)雜的限制性酶切圖譜，費(fèi)盡心力找到適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶組合，然后熬過漫長的連接和轉(zhuǎn)化過程，希望能夠生成少數(shù)正確插入的克隆。那如果能夠擺脫所有這些繁瑣的步驟，在任意位點(diǎn)切割質(zhì)粒，然后無縫插入你的靶DNA，會怎么樣呢？

南佛羅里達(dá)大學(xué)Morsani醫(yī)學(xué)院變態(tài)反應(yīng)和免疫學(xué)部助理教授王佳望（Jia-Wang Wang，音譯）博士說：“我們過去一直在構(gòu)建一個(gè)大尺寸的基因敲入靶載體，zui終的步驟是將一個(gè)青色熒光蛋白( cyan fluorescent protein , CFP)插入到載體中。由于插入位點(diǎn)沒有*的限制酶位點(diǎn)，我們幾次嘗試一種連接四個(gè)片段的策略，沒有取得成功?！?/span>

這一克隆困境使得王佳望和研究小組重新思考他們的策略，zui終他們轉(zhuǎn)向了另一種基因組工程系統(tǒng)——CRISPR/Cas9。他們在近期發(fā)表在《生物技術(shù)》（BioTechniques）雜志上的新研究論文中詳細(xì)描述了這種體外“CRISPR克隆”法。

王佳望說：“我們認(rèn)為，既然CRISPR/Cas9已被成功應(yīng)用于編輯許多物種的基因組，應(yīng)該也可以用作為一種特殊的‘限制性內(nèi)切酶’來特異地切割DNA進(jìn)行體外克隆?！?/span>

王佳望的克隆方法很簡單：他利用了Cas9酶精細(xì)的特異性和體內(nèi)切割能力，將DNA段片克隆到了體外的“挑戰(zhàn)性”載體中。以往的體內(nèi)研究證實(shí)，結(jié)合單導(dǎo)向RNA (single-guide RNA,sgRNA), Cas9能夠以遠(yuǎn)超限制性內(nèi)切酶的特異性定點(diǎn)切割DNA。王佳望意識到，如果能夠在體外實(shí)現(xiàn)這樣的特異性切割，再結(jié)合一種DNA連接方法，就可以構(gòu)建出一種強(qiáng)大的、改造和克隆DNA段片的新工具。

為了確定他們的方法的可行性，作者們采用一個(gè)22-kb的質(zhì)粒和針對T3啟動子的一條sgRNA進(jìn)行了測試。他們設(shè)計(jì)了多個(gè)長度不同的sgRNA版本來評估脫靶效應(yīng)及切割效率。數(shù)據(jù)顯示，Cas9與一個(gè)19-bp的sgRNA一起能夠?qū)崿F(xiàn)有效切割，且沒有脫靶效應(yīng)，證實(shí)了這一系統(tǒng)可用于特異的位點(diǎn)切割大型DNA載體實(shí)現(xiàn)克隆應(yīng)用。為了進(jìn)一步加快和簡化克隆過程，作者們隨后利用了2009年開發(fā)的Gibson assembly方法，將一個(gè)DNA段片無縫插入到了CRISPR/Cas9線性化的22-kb大小的質(zhì)粒中。

王佳望指出，盡管這一技術(shù)非常強(qiáng)大，能夠有效地應(yīng)用于大量的載體，那些有興趣在自己的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用這一技術(shù)的研究人員在制備過程中仍然要謹(jǐn)慎剪切這樣的大型載體，利用高質(zhì)量的Cas9酶來獲得*的結(jié)果。

雖然，較為常規(guī)的克隆應(yīng)用可能不需要這種新的“CRISPR克隆”方法，但是顯然有些時(shí)候你實(shí)驗(yàn)室的工具箱中有這樣的一項(xiàng)技術(shù)會特別的有用。王佳望和合著者指出，當(dāng)采用諸如細(xì)菌人工染色體或腺病毒載體一類的大型載體開展研究，無法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，想找到*的酶切位點(diǎn)面對著挑戰(zhàn)之時(shí)，以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的克隆技術(shù)將為急需的DNA克隆提供一條更快、更有效的途經(jīng)。

轉(zhuǎn)載自：生物通

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