組織免疫組化(IHC)

實驗方法

1）石蠟切片自37℃恒溫箱過夜烤片后取出，室溫放置5分鐘后，雙蒸水浸泡5分鐘，0.01M PBS（pH7.2-7.4）浸洗5分鐘×3次。

2）加入EDTA緩沖液，微波至沸騰拿出微波爐，自然冷卻至室溫。

3）0.1% triton X-100透膜10分鐘。PBS洗三次。

4）3%過氧化氫（in PBS）RT,15min。重復此步驟操作1次。

5）用吸水紙擦干組織周圍的玻片，用組化筆畫圈，滴加免疫羊血清封閉30分鐘（室溫）或過夜（4℃）。

6）傾去封閉血清，不用清洗，直接滴加稀釋好的一抗，4℃濕盒過夜。次日取出，傾去一抗，PBS清洗三次。

7）滴加稀釋的二抗，37℃孵育1h。傾去二抗，PBS清洗3遍。

8）加DAB顯色劑，每樣加上100ulDAB,5-20s內(nèi)顯微鏡下觀察有無特異性信號。顯色后立即用蒸餾水沖洗終止反應。如無特異性表達可適當延長DAB顯色時間。

9）蘇木精染色液復染，蒸餾水洗2min，蘇木精復染10s-15min，蒸餾水洗，鹽酸酒精（70%乙醇：鹽酸=99:1）分化20s，蒸餾水洗，稀氨水（1%）反藍10s。流水沖洗，鏡下觀察。

10）脫水透明，95%乙醇5min，100%乙醇5min，2次（2瓶無水乙醇）.二甲苯Ⅰ10min二甲苯Ⅱ10min。封片，中性樹膠封片。

實驗周期：組織免疫組化（IHC）1-2周，組織免疫熒光（IF）-普通熒光顯微鏡觀察1-2周（≤50個樣本），組織免疫熒光（IF）-共聚焦熒光顯微鏡3周（≤20個樣本）。

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