如何掌握從頭測序，提升蛋白質鑒定的準確率？檢測技術服務詳情介紹

從頭測序（de novo sequencing）是dànbáizhì組學研究中的關鍵技術，特別適用于缺乏參考數(shù)據(jù)庫或存在未知蛋白變體的生物體系。相較于依賴數(shù)據(jù)庫比對的質譜鑒定方式，從頭測序通過直接解析質譜數(shù)據(jù)中的肽段離子信息，推斷其氨基酸序列，從而實現(xiàn)更全面、更jīngquè的dànbáizhì識別。

一、從頭測序的原理與優(yōu)勢

從頭測序是指在無參考數(shù)據(jù)庫或數(shù)據(jù)庫信息不完善的情況下，通過質譜（MS/MS）數(shù)據(jù)直接推斷肽段序列的技術。其主要原理是利用串聯(lián)質譜中b離子和y離子的斷裂模式，分析每個片段的質量差異，從而還原出肽鏈的氨基酸序列。

從頭測序具有以下優(yōu)勢：

• 能識別物種特異性蛋白或突變體，適用于非模式生物

• 對于具有PTM（翻譯后修飾）的未知肽段具有更強適應性

• 可發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中未收錄的新肽段和dànbáizhì異構體

二、影響從頭測序準確率的關鍵因素

1、MS/MS譜圖質量

從頭測序的基礎是MS/MS譜圖的清晰度和碎裂完整性。優(yōu)質的譜圖具備以下特征：

• 豐富且連續(xù)的b/y離子系列

• 高信噪比（S/N）

• zuì小化中性丟失和多電荷干擾

若譜圖缺乏關鍵離子信息，即使使用優(yōu)良算法也難以準確還原序列。

2、離子碎裂方式

不同碎裂方式對譜圖質量和肽段信息影響顯著。

• CID（碰撞誘導解離）：常用于傳統(tǒng)測序，但對長肽段和帶有修飾的肽段效果不佳

• HCD（高能碰撞解離）：保留更多高m/z值離子，適合高分辨率分析

• ETD/EThcD：適用于識別翻譯后修飾和保留側鏈信息的測序任務

3、肽段長度與序列復雜性

過短的肽段容易產(chǎn)生重復序列，導致序列歧義。過長的肽段則可能因碎裂不wánquán，信息丟失。此外，氨基酸組成也影響斷裂傾向。

三、數(shù)據(jù)分析流程的優(yōu)化策略

1、選用高性能的從頭測序算法

當前主流的從頭測序軟件包括 PEAKS、Novor、pNovo 等，它們各具特色：

• PEAKS：結合數(shù)據(jù)庫搜索與從頭測序，適合高通量分析

• Novor：實時處理MS/MS數(shù)據(jù)，適合在線質譜平臺集成

• pNovo：基于機器學習優(yōu)化的打分系統(tǒng)，提高肽段識別精度

合理選擇算法，并根據(jù)質譜平臺調整參數(shù)，是提升準確率的dìyī步。

2、結合混合策略提升置信度

即便從頭測序結果具有一定不確定性，仍可通過如下方法增強結果置信度：

• 數(shù)據(jù)庫匹配驗證：將從頭推斷的序列用于二次數(shù)據(jù)庫匹配確認

• 一致性篩選：在不同樣本、重復實驗中篩選穩(wěn)定存在的肽段

• 融合多譜圖信息：同一肽段多次碎裂譜圖進行合并分析，有助于識別低豐度肽

3、多維質量控制體系

建立系統(tǒng)的質量控制流程有助于排除低可信度序列，常用方法包括：

• 控制全局FDR（False Discovery Rate）；

• 設置打分閾值（如PEAKS score ≥ 80）；

• 去除存在大量中性丟失或僅有單一離子系列的譜圖。

四、從實驗設計提升從頭測序效率

1、dànbáizhì酶解策略

• 組合酶解（如yídànbáiméi+mídànbáiméi）提高覆蓋度

• 非特異性酶解生成更豐富的肽段組合

• 靶向長肽段切割策略，配合ETD提高識別率

2、上樣量與分離策略

dànbáizhì的上樣量需精細控制——過低信號不足，過高則導致離子抑制?？梢酝ㄟ^以下手段優(yōu)化：

• 使用高效的納升液相色譜系統(tǒng)（nanoLC）提高分離度

• 引入多維分離策略，如高pH反相色譜+低pH分離串聯(lián)

• 采用在線濃縮提高低豐度肽的檢測率

3、選擇合適的質譜平臺

• Orbitrap平臺（如Exploris、Fusion Lumos）：具備高分辨率、快掃描速率

• Q-TOF質譜：適用于需要較高精度和速度的實時定序

• 具備多種碎裂模式的質譜系統(tǒng)，可支持復雜樣本中的修飾識別

從頭測序不僅在非模式生物、未知修飾蛋白識別中展現(xiàn)出強大優(yōu)勢，也為臨床標志物發(fā)現(xiàn)、抗體測序等前沿領域打開新路徑。掌握從頭測序的核心技術，優(yōu)化實驗與數(shù)據(jù)分析流程，將顯著提升dànbáizhì組學研究的深度與廣度。百泰派克生物科技持續(xù)優(yōu)化從頭測序服務方案，助力科學家挖掘每一個關鍵序列的潛力。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進行分析，提供基于質譜的蛋白測序分析服務，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務。對于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優(yōu)勢：

1.采用目前世界上優(yōu)良的質譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學、靶向dànbáizhì組學、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種dànbáizhì組學分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫(yī)學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標記物;

2.體內體外多種dànbáizhì標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學分析，分析更系統(tǒng)準確。

三、單細胞質譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質譜流式系統(tǒng)進行單細胞質譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質量譜，zuì后將原子質量譜數(shù)據(jù)轉換為細胞表面和內部的信號分子表達量。

※服務優(yōu)勢：

1.技術優(yōu)良，*技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右，而流式質譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現(xiàn)了數(shù)量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質譜結果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向。除常規(guī)蛋白外，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從zuì小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質生物藥物分析服務，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質譜多組學優(yōu)質服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質量控制體系，zhuānyè提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質量研究服務；

3.業(yè)務范圍覆蓋dànbáizhì組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等；

4.七大質量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求；

5.服務3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質的生物質譜分析服務!

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