一、細(xì)胞基本屬性：

包被條件： PLL(0.1mg/ml)，明膠(0.1%)

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：1:2

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

原代細(xì)胞實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈內(nèi)皮細(xì)胞樣，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下，細(xì)胞可傳2-3代；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實驗。

客戶收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個培養(yǎng)瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)。

5)原瓶內(nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理。

4. 細(xì)胞實驗

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實驗器皿（如玻璃爬片、培養(yǎng)板、共聚焦培養(yǎng)皿等）時，需要對實驗器皿進(jìn)行包被，以增強細(xì)胞貼壁性，避免細(xì)胞因沒貼好影響實驗；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類而定。懸浮/半懸浮細(xì)胞無需包被。
公司正在出售的產(chǎn)品：
人黑色素瘤細(xì)胞MNT-1 (STR鑒定正確)

人B淋巴細(xì)胞急性白血病細(xì)胞BALL-1 (STR鑒定正確)
人肝星形細(xì)胞LX-2 (STR鑒定正確)
人肝癌細(xì)胞帶熒光素酶HuH-7+LUC (STR鑒定正確)
小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤瘤株G422（種屬鑒定）
人彌漫大B淋巴瘤細(xì)胞HBL-1(STR鑒定正確)
人burkitt淋巴瘤細(xì)胞CA46(STR鑒定正確)
大鼠回腸細(xì)胞IEC-18（種屬鑒定）
小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F0（種屬鑒定）
小鼠腎髓質(zhì)細(xì)胞mIMCD-3 （種屬鑒定）
小鼠睪丸畸胎瘤細(xì)胞P19（種屬鑒定）
人正常乳腺細(xì)胞Hs578bst(STR鑒定正確)
人整合SV40基因的乳腺上皮細(xì)胞HBL-100(STR鑒定正確)
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-157(STR鑒定正確)
人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB(STR鑒定正確)
Desulfovibrio fructosivorans食果糖脫硫弧菌
Desulfotomaculum ruminis瘤胃脫硫腸狀菌
Geobacillus thermoglucosidasius熱葡糖苷地芽孢桿菌
Geobacillus thermoleovorans喜熱噬油地芽孢桿菌
Aneurinibacillus migulanus米氏解硫胺素芽孢桿菌
Sporolactobacillus inulinus菊糖乳芽孢桿菌
Desulfobacterium macestii麥斯塔脫硫桿菌
Ureibacillus thermosphaericus熱球狀尿素芽孢桿菌
Desulfomicrobium escambiense埃斯坎比亞河脫硫微菌
Brevibacillus thermoruber熱紅短芽孢桿菌
大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Sporosarcina globispora圓孢生孢八疊球菌
Paenibacillus apiaries蜜蜂類芽孢桿菌
Clostridium defluvii污水梭菌
Halorubrum distributum廣布鹽紅菌
Desulfomicrobium norvegicum挪威脫硫微菌