花生凝集素(PNA)elisa試劑盒顯色的重要性：

顯色是ELISA中的zui后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。

OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。

TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和SDS等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。

花生凝集素(PNA)elisa試劑盒標本的處理：

（1）細胞培養(yǎng)上清液

根據(jù)需要用試劑盒中的標準稀釋液稀釋樣品，然后按照說明書所述方法檢測。*稀釋濃度是稀釋5倍。

（2）腦脊液

根據(jù)需要用試劑盒中的標準稀釋液稀釋樣品，然后按照說明書所述方法檢測。*稀釋濃度是5倍。

（3）血漿

①用EDTA2K離心收集在真空血液收集管中的血液，5,000×g，15分鐘，4℃，分離血漿樣品，然后儲存在零下80℃直到使用。

②用試劑盒中的標準稀釋液5倍稀釋血漿以避免血漿中的干擾物質(zhì)影響檢測，按照說明書方法檢測。

花生凝集素(PNA)elisa試劑盒基本操作步驟：

1、 試劑準備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。*設(shè)置復(fù)孔進行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài)；同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請精確 配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。