革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，媒染劑碘液進入菌體后與結(jié)晶紫結(jié)合，革蘭氏陽性菌對碘與結(jié)晶紫攝取量多且牢固，不易被酒精脫色。革蘭氏陰性菌對碘與結(jié)晶紫攝取量少，不牢固，易被酒精脫色。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。 
革蘭氏染色液操作步驟： 
1、標本處理： 
（1）.有菌部位的標本，如痰液、糞便、各種拭子、創(chuàng)面等可直接涂片。 
（2）.無菌部位的標本，如腦脊液、胸水、腹水、膽汁、尿液、關(guān)節(jié)液等，應取適量標本（zui高可達5-7ml）,經(jīng)3000rpm 離心10min.，取沉渣涂片染色。 
2、涂片制作：菌液涂片時，用接種環(huán)沾取菌液點在載玻片上，標本可直接在玻片上涂布；菌落涂片時，先取生理鹽水一滴，置玻片上，用接種針挑取菌落在鹽水中涂布。制作的涂片應自然干燥，并經(jīng)火焰固定，固定的溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為準，否則可能使細菌形態(tài)改變。將固定后的涂片進行染色。  
3、染色方法： 
革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。 
（1）.加上結(jié)晶紫后，染色1分鐘，水洗。 
（2）.加上碘液后染色1分鐘，水洗。 
（3）.加上95%酒精,搖動玻片,根據(jù)涂片厚度,脫色約30-60秒，水洗,吸去水分。 
（4）.加上蕃紅后，染色1分鐘，水洗。 
（5）.吸干或在空氣中涼干后，油鏡鏡檢。 
4．結(jié)果觀察：紫色為革蘭氏陽性，紅色為革蘭氏陰性。 
 革蘭氏染色液[注意事項]： 
1．標本涂片不能太厚，嚴格按操作要求進行。 
2．玻片通過火焰溫度不能太高。 
3．若涂片較厚，應延長脫色時間，直至不再出現(xiàn)紫色為止。 
4．碘液變透明，則不能使用。 
5. 水洗時動作要輕柔,沿載玻片對角線方向用洗瓶沖洗,以免把菌體沖掉。