一.MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 產(chǎn)品用途 

用于MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)。在整個(gè)培養(yǎng)過程中不需要添加血清?？蛇_(dá)到原來的DMEM+10%血清的效果。

提請注意：
1. 該產(chǎn)品為無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品。不是添加了血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。
2. 細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不需要經(jīng)過血清濃度逐步降低的過程，不需細(xì)胞馴化。細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不需要經(jīng)過血清濃度逐步降低的過程，不需細(xì)胞馴化。

二. MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基  產(chǎn)品規(guī)格 

500ml/瓶。20瓶/箱。

三.MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基  產(chǎn)品性能

1. MDCK細(xì)胞培養(yǎng)基中加入了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白以及所需要的貼壁因子等物質(zhì)，其化學(xué)成分明確。在整個(gè)培養(yǎng)過程中不需要添加血清。

2. 細(xì)胞連續(xù)傳代32代，細(xì)胞特性沒有改變。

3. 細(xì)胞倍增時(shí)間小于16小時(shí)。

4. 細(xì)胞剛轉(zhuǎn)入無血清細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，生長相比*培養(yǎng)基略有遲緩，經(jīng)過2-3代的傳代后，生長即可達(dá)到*培養(yǎng)基（90％DMEM+10％胎牛血清）所培養(yǎng)的水平。

四.MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基  使用說明

此產(chǎn)品的使用方法跟*培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）的相同。
不經(jīng)過血清馴化的MDCK細(xì)胞，前5代左右（與MDCK細(xì)胞的初始狀態(tài)有關(guān)）狀態(tài)可能會稍差。

1、MDCK細(xì)胞復(fù)蘇
1）從液氮罐中取出凍存管迅速置于37℃水浴鍋中，使管中的液體在1min內(nèi)融化。
2）在超凈工作臺中用無菌吸管吸取10mL預(yù)溫的MDCK無血清培養(yǎng)基到15mL離心管中，凍存管用75%酒精擦拭表面后，將細(xì)胞懸液加入 15mL離心管中，吹吸混勻。
3）800rpm離心3min，去除上清液，用6mL預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種細(xì)胞密度為5×10⁵cells/mL。
4） 37℃,5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天至細(xì)胞鋪滿瓶底的80%-90%進(jìn)行傳代。

2、MDCK細(xì)胞傳代（以T25瓶為例）
1）處于對數(shù)生*的細(xì)胞長至融合度達(dá)到80％-90％時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS或不含鈣鎂的Hank's液清洗細(xì)胞3遍。
2）加入1mL基因重組胰蛋白酶，37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中消化至細(xì)胞收縮變圓，輕拍培養(yǎng)瓶，鏡下可觀察到細(xì)胞移動加入培養(yǎng)基終止消化。
3）如果以1：6比例傳代，加入35mL MDCK無血清培養(yǎng)基。如果以1：4比例傳代，需加25mL MDCK無血清培養(yǎng)基。
?4）分瓶后，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿瓶底80%-90%后進(jìn)行下一次傳代（一般2-3天傳代一次）。

3、流感病毒的分離與培養(yǎng)
1） 選取融合度90％-100％且處于對數(shù)生*的MDCK細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS或不含鈣鎂的Hank’s液清洗細(xì)胞2-3遍。
2）加入200 μL的流感病毒樣本，溫和搖動數(shù)次。
3）置于37℃，5% CO 培養(yǎng)箱中吸附1-2小時(shí)。
4）吸出接種物，加入6 mL流感病毒分離無血清培養(yǎng)基（使用前需要添加抗生素及終濃度為2ug/mL的TPCK-胰酶）于培養(yǎng)瓶中，放置 于33℃-35℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察病變。
5）當(dāng)75%-*的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)即可準(zhǔn)備收獲病毒。
6）溫和搖動細(xì)胞瓶2-3次。將培養(yǎng)瓶中的病毒液置于15mL離心管中。
7）為了提高病毒滴度，可將離心管置于-70度冰箱或液氮上方反復(fù)凍融一到兩次。
8）收獲的病毒液可立即進(jìn)行血凝試驗(yàn)，或負(fù)80度冰箱冷凍*保存。

4、MDCK細(xì)胞凍存
1）選取融合度達(dá)80%-90%且處于對數(shù)生*的MDCK細(xì)胞用于凍存。
2）依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管并計(jì)數(shù)，800rpm離心3min。
3）去除上清液，加入商品化的細(xì)胞凍存液（凍存液需要提前預(yù)冷），凍存液中細(xì)胞的密度為5×10⁶ cells/mL。用吸管輕輕吹打使 細(xì)胞混勻，然后分裝至無菌凍存管中，每支凍存管加液1mL。
4）細(xì)胞經(jīng)過程序降溫后置于液氮中保存。（如用yocon無血清凍存液，無需程序降溫，直接-80℃凍存，12h后存入液氮，*保存。）

五.MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

	MDCK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中 的培養(yǎng)狀態(tài)（200×鏡下）		MDCK細(xì)胞在需血清培養(yǎng)基中 ?的培養(yǎng)狀態(tài)（200×鏡下）
	MDCK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中傳代第10代		MDCK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中傳代第20代
	MDCK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中傳代第30代		MDCK細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中傳代第32代