LLT小鼠Lewis肺癌瘤株細(xì)胞系
LLT小鼠Lewis肺癌瘤株細(xì)胞系源自 C57BL/6 小鼠的自發(fā)性 Lewis 肺癌組織，是保留肺泡上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化特征和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移傾向性的經(jīng)典肺部腫瘤模型，在 Lewis 肺癌的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移機制、氣道侵襲特性及抗腫瘤藥物篩選研究中具有重要價值，為解析肺癌的原發(fā)灶形成與肺內(nèi)播散規(guī)律提供了理想工具。
該細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的 Lewis 肺癌細(xì)胞形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細(xì)胞呈多邊形或短梭形，以貼壁生長為主，排列呈不規(guī)則片狀或巢狀，模擬肺腺泡上皮的分化特征。細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核質(zhì)比高，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，可見 1-2 個明顯核仁，核分裂象每 10 個高倍視野 6-8 個，胞質(zhì)豐富，呈嗜酸性，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見空泡（類似肺泡表面活性物質(zhì)分泌結(jié)構(gòu)）。電鏡下可見細(xì)胞間存在橋粒連接，胞質(zhì)內(nèi)有少量板層小體，符合肺癌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點。免疫表型分析顯示，細(xì)胞高表達(dá) Lewis 肺癌特異性標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白 7（CK7）和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子 - 1（TTF-1），流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性率分別達(dá) 90% 和 85%，同時表達(dá)增殖相關(guān)抗原 Ki-67（陽性率 80%），而鱗癌標(biāo)志物 p63 表達(dá)陰性，證實其肺腺癌的組織來源特性。
體外培養(yǎng)體系中，LLT 細(xì)胞展現(xiàn)出穩(wěn)定的增殖能力與強肺內(nèi)侵襲潛能。最適培養(yǎng)條件為含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，添加 1% 谷an酰胺，在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 60 小時，對數(shù)生長期細(xì)胞活力達(dá) 95% 以上，倍增時間約 40 小時。其顯著特點是體外可形成類似肺泡結(jié)構(gòu)的細(xì)胞簇，貼壁生長的細(xì)胞相互連接形成腺樣腔隙，這種特性與其高表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子 E - 鈣粘蛋白相關(guān)（表達(dá)量較其他肺癌細(xì)胞系高 30%）。Transwell 侵襲實驗顯示，其穿透肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的能力是其他肺癌細(xì)胞系的 2 倍，這種肺內(nèi)定向侵襲性依賴于高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶 - 2（MMP-2），酶活性較其他肺癌細(xì)胞高 4 倍，可高效降解肺毛細(xì)血管基底膜。軟瓊脂克隆形成率達(dá) 45%，克隆形態(tài)呈圓形或不規(guī)則形，邊緣有細(xì)小突起，連續(xù)傳代 50 次后，CK7 表達(dá)及肺內(nèi)侵襲能力無明顯衰減，凍存復(fù)蘇存活率超 90%。
在動物模型中，LLT 細(xì)胞的成瘤與轉(zhuǎn)移模式j(luò)i具特點。將 1×10?個細(xì)胞皮下接種 C57BL/6 小鼠，10 天形成實體瘤，20 天出現(xiàn)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶（轉(zhuǎn)移率 80%），30 天肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量達(dá) 20-30 個 / 肺葉，模擬人類 Lewis 肺癌的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移偏好。病理切片顯示原發(fā)瘤呈巢狀生長，肺轉(zhuǎn)移灶沿肺泡間隔浸潤，破壞肺組織結(jié)構(gòu)，免疫組化可見 TTF-1 陽性細(xì)胞在肺內(nèi)彌漫分布。熒光標(biāo)記追蹤證實，腫瘤細(xì)胞通過肺循環(huán)定植于肺組織，高表達(dá)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 CD44v6，黏附率達(dá) 55%，CD44v6 抗體處理可使肺轉(zhuǎn)移率下降 60%。
發(fā)病機制研究揭示其te有的分子異常。基因測序顯示，細(xì)胞存在 KRAS 基因第 12 密碼子突變（G12C）和 EGFR 基因擴增，導(dǎo)致 RAS/RAF/MEK 通路持續(xù)激活，Western blot 檢測顯示磷酸化 MEK（p-MEK）和磷酸化 ERK（p-ERK）表達(dá)量較正常肺泡上皮細(xì)胞高 7 倍和 9 倍，使用 MEK 抑制劑處理后，細(xì)胞增殖率下降 65%，凋亡率上升 45%，證實該通路在其惡性增殖中的核心作用。此外，細(xì)胞中 PI3K/Akt 信號通路異常激活，磷酸化 Akt（p-Akt）水平較正常細(xì)胞高 6 倍，可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）分泌，VEGF 是誘導(dǎo)肺內(nèi)血管生成的關(guān)鍵因子，LLT 細(xì)胞分泌的 VEGF 量是正常肺泡上皮細(xì)胞的 4 倍，抗 VEGF 抗體處理可使肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少 55%。
轉(zhuǎn)移機制方面，LLT 細(xì)胞的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移涉及多重調(diào)控。除 CD44v6 介導(dǎo)的血管黏附外，細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體 CXCR4，可響應(yīng)肺組織高濃度的 CXCL12，遷移能力是 CXCR4 陰性細(xì)胞的 2.2 倍，CXCR4 拮抗劑處理可使肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少 50%?；蛐酒治鲲@示，轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞中與肺組織定植相關(guān)的基因 ITGA5（整合素 α5）表達(dá)上調(diào)，該分子可與肺基質(zhì)中的纖維連接蛋白結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肺內(nèi)的存活與增殖，ITGA5 抗體處理可使轉(zhuǎn)移灶體積縮小 60%。
在藥物篩選應(yīng)用中，LLT 細(xì)胞是評估 Lewis 肺癌靶向藥物的有效模型?；谄?KRAS G12C 突變特性，對 KRAS 抑制劑敏感，半數(shù)抑制濃度（IC50）約 0.5μM，藥物處理后細(xì)胞 G1 期比例增加 40%，凋亡率上升 35%。體內(nèi)實驗顯示，KRAS 抑制劑口服可使 C57BL/6 小鼠皮下腫瘤體積縮小 70%，肺轉(zhuǎn)移率從 80% 降至 30%，療效顯著。其肺內(nèi)轉(zhuǎn)移特性使其成為抗轉(zhuǎn)移藥物的理想模型，某新型 MMP-2 抑制劑可減少肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量 65%，同時抑制原發(fā)瘤生長。
在腫瘤微環(huán)境研究中，LLT 細(xì)胞與肺巨噬細(xì)胞的相互作用為解析轉(zhuǎn)移機制提供了線索。共培養(yǎng)實驗顯示，巨噬細(xì)胞分泌的 IL-6 可激活腫瘤細(xì)胞的 STAT3 通路，使 Bcl-2 表達(dá)上調(diào)，抗凋亡能力增強 50%，IL-6 中和抗體可阻斷這種促進(jìn)作用。在缺氧微環(huán)境（1% O?）中，細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)糖酵解相關(guān)基因 GLUT1 表達(dá)，使細(xì)胞在低氧環(huán)境下的存活率達(dá) 90%，HIF-1α 抑制劑處理可降低其缺氧適應(yīng)能力。
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