Protein A(Protein A)ELISA試劑盒

 (用于血清、血漿、組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi))

一、原理：

   本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗 Protein A 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 Protein A與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗Protein A，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，后加終止液硫酸，在405nm處測OD值，Protein A濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中Protein A濃度。

二、試劑盒組成（2-8℃保存）：具體組成部分看試劑盒內(nèi)的說明書為準。

三、準備試劑與收集血樣

 1、收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清可能需要稀釋,請先做預實驗,以確定稀釋倍數(shù)。

2、標準品液配制：具體看以試劑盒內(nèi)的說明書為準。

3、樣品可以使用10×標本稀釋液來稀釋，此時PH 在7.2-8.5之間。蛋白濃度在1mg/ml以下。比如10倍稀釋：（20ul樣品＋160ul的蒸餾水+20ul的10×標本稀釋液）

4、Protein A 樣品如果含有Ig或Ig片段，需預處理：將裝有Protein A 樣品的EP管放入沸水中煮浴10 min；取出樣品，冷卻到室溫；13000 g離心4 min；留取上清備用。

5、洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

 四、檢測程序：

 1、加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃40分鐘。

 2、洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

  3、每孔加入蒸餾水和抗體工作液各50ul(空白除外)。將反應板充分混勻后置37℃20分鐘。

 4、洗板：同前。

 5、每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃10分鐘。

 6、洗板：同前。

 7、每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。

 8、每孔加入100ul終止液混勻。

 9、30分鐘內(nèi)用酶標儀在405nm處測吸光值。

 五、結(jié)果計算與判斷：

 1、所有OD值建議減除空白值后再行計算。如空白OD低于0.1，也可以直接計算。

 2、以標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，使用軟件作圖，畫出標準曲線。

 3、根據(jù)樣品OD值計算出相應Protein A含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。軟件可以向本公司郵件索取。

 六、試劑盒性能

   1、靈敏度：小的Protein A 檢測濃度小于16pg/ml。

    2、特異性：可同時檢測重組或天然的Protein A。不與其它細胞因子有交叉反應。

  3、重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10.6％。

 七、注意事項

 1、以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

  2.   洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導致出現(xiàn)誤差及OD值錯誤地升高。

  3.   檢測時所有試劑都要恢復到室溫。板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

  4.   試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過深會出現(xiàn)絮狀物，屬正?，F(xiàn)象，不影響結(jié)果判讀。

  5. 說明書中試劑盒組成為96T的量，48T的量應減半！

 6.   本試劑盒宜置4^oC冰箱保存。僅用于科研，不能用于臨床診斷！