引言

制備擬胚體

多能性驗(yàn)證

大限度提高分化效率

結(jié)論

材料

參考文獻(xiàn)

引言

本書(shū)論述了在多能干細(xì)胞（PSC）來(lái)源的胚胎發(fā)育與分化的生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)的重要性。本文包含了擬胚體（EB）技術(shù)的概述，并就生成擬胚體的不同技術(shù)進(jìn)行了比較。同時(shí)，也針對(duì)驗(yàn)證新建立PSC細(xì)胞系多能性的應(yīng)用，對(duì)畸胎瘤分析與EB技術(shù)進(jìn)行了比較和討論。后，本文還對(duì)近通過(guò)3D培養(yǎng)來(lái)提升分化效率的文獻(xiàn)進(jìn)行了一個(gè)簡(jiǎn)短的描述。

制備擬胚體

擬胚體（EB）是PSC的三維聚集物，可以重現(xiàn)胚胎的結(jié)構(gòu)，這也意味著其中包含了完整的三個(gè)胚層：外胚層、內(nèi)胚層和中胚層）。EB分化的初始階段與植入后早期胚胎的分化過(guò)程極其相似¹。EB當(dāng)中先分化的細(xì)胞類型為原始內(nèi)胚層的外層，這也是分泌出基底膜的一層細(xì)胞。

分泌出來(lái)的胞外基質(zhì)包裹著內(nèi)部的原始外胚層細(xì)胞，相當(dāng)于胚胎的外胚層。未與基底膜接觸的原始外胚層細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡現(xiàn)象，進(jìn)而形成一個(gè)囊狀結(jié)構(gòu)。在胚胎中，胚外信號(hào)中心在外胚層形成了一個(gè)精確的原條位點(diǎn)（這也是原腸的起始位點(diǎn)），進(jìn)而形成中胚層與內(nèi)胚層。然而， EB缺少胚外信號(hào)中心，因此相比胚胎而言，EB原始外胚層向中胚層與內(nèi)胚層的分化過(guò)程顯得混亂和缺乏組織性。兩個(gè)研究組提出，EB比之前的猜想更有組織性；如果在正確的時(shí)間給予正確的信號(hào)，它們的組織性會(huì)得到極大提升，進(jìn)而形成與正常胚胎發(fā)育十分相近的過(guò)程，其中也包括了原腸胚的形成過(guò)程^{2, 3}。這些特性使得EB成為了一個(gè)*的模式系統(tǒng)，通過(guò)這一系統(tǒng)，可在一個(gè)原來(lái)難以介入的時(shí)間點(diǎn)研究各類胚胎發(fā)育過(guò)程，特別在人源細(xì)胞研究中尤其重要。^{4, 5}.

目前可通過(guò)多種方法來(lái)制備EB，部分方法如圖1所示。這些方法重要的特點(diǎn)是能夠抑制PSC的表面貼壁效應(yīng)，促使它們通過(guò)依賴E-鈣粘著蛋白的粘附通路相互粘連起來(lái)。

圖1 部分制備擬胚體的方法。圖片源自⁶。

培養(yǎng)皿（靜止）、旋轉(zhuǎn)瓶和低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器等懸浮培養(yǎng)裝置易于設(shè)置和維護(hù)，但會(huì)形成不同大小的EB，并聚集成各類形狀的團(tuán)塊（圖2）。EB大小增加會(huì)降低質(zhì)量傳輸速率⁷。不僅如此，業(yè)界普遍認(rèn)為EB大小和形狀的改變還會(huì)改變分化模式⁸。此外，一旦原始內(nèi)胚層開(kāi)始分泌胞外基質(zhì)，EB就將開(kāi)始隨機(jī)貼壁（即使是培養(yǎng)皿的疏水表面），這會(huì)導(dǎo)致貼壁與懸浮EB的細(xì)胞系出現(xiàn)巨大的特性差異。使用旋轉(zhuǎn)瓶與低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器可減少聚集現(xiàn)象，并避免之前所提到的貼壁現(xiàn)象，不過(guò)使用這類培養(yǎng)容器需要在懸浮與剪切力造成的細(xì)胞損傷之間找到平衡點(diǎn)⁹。強(qiáng)制聚集培養(yǎng)技術(shù) - 使用圓底低粘附平板、離心管和工程改造的微孔培養(yǎng)皿（圖1中未展示）等容器 - 用戶可通過(guò)測(cè)定每孔中加入的細(xì)胞數(shù)目，精確控制EB的大小。

圖2 培養(yǎng)于低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器（A），懸滴培養(yǎng)（B）和在細(xì)菌培養(yǎng)皿中靜態(tài)懸浮培養(yǎng)（C）的EB圖片。請(qǐng)注意懸滴培養(yǎng)的EB在尺寸與形狀上都獲得了的均一度。圖片源自⁹。比例標(biāo)尺 = 500 μM

在微孔和試管中強(qiáng)制聚集培養(yǎng)的缺點(diǎn)之一是，通過(guò)剛性的人造塑料界面人為地決定和限制了EB的形狀，進(jìn)而可能影響分化過(guò)程¹⁰。同時(shí)，從小孔和試管中取出EB而不影響到它們的結(jié)構(gòu)，操作起來(lái)也很有難度。圖1所示的優(yōu)勢(shì)的方法為懸滴培養(yǎng)。種植細(xì)胞的數(shù)量可控制懸滴EB的大小，EB的形狀也不會(huì)受到任何人工塑料基質(zhì)表面的限制。過(guò)去建立這些培養(yǎng)體系十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因?yàn)槟枰谄桨宓纳w子上制備懸液再反轉(zhuǎn)形成懸滴。為了給EB提供營(yíng)養(yǎng)，研究人員需要將它們轉(zhuǎn)移至另一個(gè)組織培養(yǎng)容器中，通常是細(xì)菌培養(yǎng)皿或低粘附力的培養(yǎng)皿中。

Perfecta3D^® 懸滴培養(yǎng)平板大幅改善了EB制備與培養(yǎng)流程。用戶只需在每個(gè)小孔的上方加入一滴細(xì)胞懸液，孔板的幾何構(gòu)造就會(huì)引導(dǎo)細(xì)胞和培養(yǎng)基通過(guò)一個(gè)小洞，進(jìn)而形成一個(gè)穩(wěn)定的懸滴。滴入口位于每個(gè)培養(yǎng)孔的上方，可用來(lái)更換培養(yǎng)基，添加外源胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子、小分子，也可用來(lái)加入細(xì)胞形成混合培養(yǎng)物。所有這些選項(xiàng)都為EB的分化操作帶來(lái)了極大的便利性與可控性。能方便地為培養(yǎng)物添加養(yǎng)分，意味著懸滴培養(yǎng)物可避免EB聚集或粘附在培養(yǎng)皿底部，從而使培養(yǎng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)。

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細(xì)胞多能性驗(yàn)證

當(dāng)全新的PSC細(xì)胞系建立時(shí)，用戶需對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，以確認(rèn)其真實(shí)擁有多能性。對(duì)于人源PSC細(xì)胞系而言，傳統(tǒng)的驗(yàn)證方法是包括體外的多能基因表達(dá)水平驗(yàn)證、表觀遺傳分析和EB形成分析，以及體內(nèi)的畸胎瘤分析等（圖3）。應(yīng)用于小鼠PSC細(xì)胞系更嚴(yán)格的多能性檢測(cè)方法，包括四倍體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)^{11, 12} 及宿主胚泡注射實(shí)驗(yàn)^{13, 14}, 都不適用于人PSC細(xì)胞系。一些科學(xué)家堅(jiān)持認(rèn)為畸胎瘤分析是驗(yàn)證人PSC多能性的檢測(cè)法，是確定新細(xì)胞系多能性的必要手段。不過(guò)，業(yè)界對(duì)于畸胎瘤分析所采用的方法存在極大的分歧，都希望建立更為*的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟，從而對(duì)新建立的PSC細(xì)胞系之間進(jìn)行結(jié)果比較¹⁵。

圖3 在腎囊下注射PSC所形成的整個(gè)畸胎瘤（A）。對(duì)包含中胚層（B，C），內(nèi)胚層（D）和外胚層（E，F(xiàn)）的組織切片進(jìn)行蘇木精與曙紅染色分析。圖像源自¹⁶。比例標(biāo)尺 = 100 μM

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)系的制備成功率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高過(guò)胚胎干細(xì)胞系，當(dāng)畸胎瘤分析被認(rèn)為十分關(guān)鍵時(shí)，該分析就更加顯得費(fèi)力、昂貴和耗時(shí)，也需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因此，如果畸胎瘤分析對(duì)于證明多能性的作用不可替代，或一組體外檢測(cè)就已足夠，那么在此之前對(duì)幾個(gè)蛋白因子進(jìn)行檢測(cè)就顯得十分重要了。

標(biāo)準(zhǔn)化的體外 EB形成操作可獲得大小和數(shù)目*的細(xì)胞，如果和定量細(xì)胞譜系分析方法聯(lián)用，在許多情況下可作為畸胎瘤檢測(cè)的有效替代手段（圖4）¹⁷。例如，由于iPSC的生物學(xué)與功能仍處于謹(jǐn)慎研究階段，許多實(shí)驗(yàn)室正在針對(duì)人類疾病模型建立多能細(xì)胞系。作為疾病模型的實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系基本無(wú)需確定致瘤性，因此進(jìn)行畸胎瘤分析就是浪費(fèi)時(shí)間和資源¹⁸。iPSC能否制備出更優(yōu)良的模型至今仍存在頗多爭(zhēng)議，這已超出了此書(shū)的論述范圍^19-21。此外，如果特定細(xì)胞類型/組織的胚胎發(fā)育過(guò)程已得到充分的研究，人們即可通過(guò)定向3D分化（請(qǐng)見(jiàn)下一節(jié)）來(lái)評(píng)估新建立PSC細(xì)胞系參與“正常”發(fā)育模型的能力，這是在畸胎瘤檢測(cè)或自然EB分化操作中無(wú)法實(shí)現(xiàn)的²²。

圖4 使用蘇木精和曙紅對(duì)EB切片進(jìn)行染色，呈現(xiàn)外胚層（A）、中胚層（B）和內(nèi)胚層（C）的分化。圖像源自¹⁷。!!比例標(biāo)尺 = 50 μM。

大限度提高分化效率

部分細(xì)胞類型和組織需3D培養(yǎng)才能實(shí)現(xiàn)PSC的大分化效率。胚胎發(fā)育不會(huì)發(fā)生在單層細(xì)胞，無(wú)數(shù)的研究案例說(shuō)明了某一胚層的胞外信號(hào)如何影響相鄰胚層的特性。例如，心臟特性只會(huì)出現(xiàn)在那些暴露于前內(nèi)胚層（所分泌）信號(hào)的中胚層細(xì)胞中²³。實(shí)際上，相對(duì)于2D培養(yǎng)，人類PSC細(xì)胞的心臟分化在3D培養(yǎng)條件下效果更好。這很可能是因?yàn)?D培養(yǎng)時(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)更接近生理狀態(tài)，存在PSC源心臟支持細(xì)胞，同時(shí)存在更天然的心肌三維整體結(jié)構(gòu)^{24, 25}。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，一些外胚層表面區(qū)域會(huì)變厚，隨后發(fā)育為感覺(jué)器官部分，如眼（光基板）和耳（耳基板）。這些區(qū)域的分化也需要二維培養(yǎng)條件無(wú)法方便形成的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。胚胎發(fā)生的復(fù)雜分化模式在3D培養(yǎng)條件下不會(huì)受限，因此在體外可能獲得更好的重復(fù)性。實(shí)際上，已有一些案例證明感覺(jué)基板擁有令人驚訝的自組織（self-patterned）分化過(guò)程：可從精確激活的EB分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞（圖5）和視網(wǎng)膜色素化表皮細(xì)胞^26-28。

圖5 示意簡(jiǎn)圖展示了PSC 3D分化為聽(tīng)覺(jué)基板進(jìn)而形成感覺(jué)上皮的過(guò)程。圖像源自²⁸。

結(jié)論

在3D環(huán)境下培養(yǎng)PSC擁有巨大的優(yōu)勢(shì)，不僅可以有效驗(yàn)證新建立細(xì)胞系的多能性，還能大限度達(dá)到實(shí)際的細(xì)胞分化效果。誘導(dǎo)天然EB分化且避免人為干擾的整體性方法是懸滴培養(yǎng)技術(shù)，目前3D Biomatrix公司的Perfecta3D的懸滴培養(yǎng)平板可幫助用戶方便地實(shí)現(xiàn)這一操作。用戶可以靈活添加試劑、小分子、胞外基質(zhì)、額外的細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)可以維持懸滴狀態(tài)，從而為創(chuàng)新和改良PSC分化方法提供了更多空間。如需了解關(guān)于3D培養(yǎng)的更多信息，請(qǐng)參見(jiàn)我們的3D細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)中心（3D Culture Knowledge Center）： http://3dbiomatrix.com/knowledge-center。
 

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參考文獻(xiàn)

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