CRISPR/Cas9整體實驗服務(wù)

1、提供項目CRISPR/Cas9整體實驗方案：客戶根據(jù)課題標(biāo)書及需做實驗的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項目方案，含課題申請書，實驗方案，實驗設(shè)計，實驗思路，實驗文獻(xiàn)等與實驗相關(guān)等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹嶒瀰f(xié)助實驗委托者完成CRISPR/Cas9整體實驗方案的設(shè)計。
2、項目評估報價：公司技術(shù)團(tuán)隊根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評估項目可行性，與客戶共同確定準(zhǔn)確的實驗項目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實驗價格。嘉美實驗協(xié)助設(shè)計的課題直接給出準(zhǔn)確的報價。
3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費(fèi)用，做好實驗初步準(zhǔn)備及項目預(yù)安排。
4、執(zhí)行服務(wù)項目：正式啟動實驗進(jìn)程，全面展開實驗，確保項目有效執(zhí)行。
5、溝通項目進(jìn)展：及時溝通反饋實驗的Newest進(jìn)展，隨時了解掌控實驗的Newest動態(tài)。
6、完成項目交付：支付剩余尾款，交付實驗結(jié)果，正確應(yīng)用實驗結(jié)果，提供售后服務(wù)。

一、嘉美實驗構(gòu)建的CRISPR/Cas9 基因編輯穩(wěn)定細(xì)胞株案例的實驗步驟
 

嘉美實驗擁有完善的 CRISPR/Cas9 載體系統(tǒng)，包括單敲除，雙敲除，缺口酶、慢病毒敲除載體和敲除載體庫等體系。并且每一個載體系統(tǒng)都有不同的標(biāo)簽（EGFP/RFP/Puro/Neo）可供選擇。同時，擁有 100 余種基因敲除的項目經(jīng)驗，可以快速、準(zhǔn)確、高效的完成任何一個基因敲除的項目。

1、設(shè)計針對 Atg10基因的 gRNA并克隆到嘉美實驗的 pGK1.1敲除載體中；
2、電轉(zhuǎn) pGK1.1（Atg10）載體至 K562細(xì)胞中；

3、Cruiser™酶切計算突變率（圖1）；

4、單克隆篩選用 Cruiser™酶切驗證獲得潛在陽性克?。▓D2）；

5、對潛在的陽性克隆進(jìn)行測序驗證，獲得純合子；

圖1. Cruiser™酶切細(xì)胞池，計算突變率。

圖3. 潛在陽性克隆測序比對結(jié)果
根據(jù)潛在陽性克隆單克隆測序驗證結(jié)果，判斷該株疑似陽性克隆的兩個親本都缺失11bp堿基，該株陽性克隆為純合子敲除細(xì)胞株。

 

二、CRISPR-Cas系統(tǒng)介紹

CRISPR-Cas系統(tǒng) The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一個細(xì)菌及古細(xì)菌進(jìn)化出來用以抵御病毒和質(zhì)粒入侵的適應(yīng)性機(jī)制。CRISPR-Cas系統(tǒng)的高效基因組編輯功能已被應(yīng)用于多種生物，包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細(xì)菌。多個科研小組的研究都顯示，與鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比較，CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向?qū)嶒炘诩?xì)胞或斑馬魚中具有相似甚至更高的效率。
 

在 II型CRISPR系統(tǒng) 中，CRISPR RNA（crRNA）與轉(zhuǎn)錄激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的復(fù)合物能特異識別基因組序列，引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）。 這個識別復(fù)合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）進(jìn)行簡化?；蚪M的靶序列中有長約20bp的片段與crRNA或sgRNA互補(bǔ)配對；靶序列末端的三核苷酸區(qū)域PAM（5’-NGG-3’）為Cas9識別位點(diǎn)，是實現(xiàn)剪切功能的關(guān)鍵。

CRISPR-Cas9體系 的RNA-DNA識別機(jī)制為基因 組工程研究提供了一項簡便而強(qiáng)大的工具。該體系其中一個重要的優(yōu)勢是Cas9蛋白可在多個不同的gRNA的引導(dǎo)下同時靶向多個基因組位點(diǎn)

圖 1. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯原理圖
 

圖2. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯。
（左）：sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶作用于基因組，形成的DSBs被非同源末端連接（NHEJ）機(jī)制修復(fù)；
（右）：sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶作用于基因組，形成DSBs，同源重組（HR）作用下，供體質(zhì)粒上的目標(biāo)基因及篩選標(biāo)記（或其他遺傳元件）在斷裂處被整合進(jìn)基因組。
 

圖3: 切口酶在結(jié)合鏈生產(chǎn)單鏈切口的原理圖