氧化應(yīng)激/衰老整體實(shí)驗(yàn)

1、提供氧化應(yīng)激與衰老整體實(shí)驗(yàn)方案：客戶根據(jù)課題標(biāo)書及需做實(shí)驗(yàn)的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項(xiàng)目方案，含課題申請書，實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)思路，實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等與實(shí)驗(yàn)相關(guān)等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹?shí)驗(yàn)協(xié)助實(shí)驗(yàn)委托者完成各氧化應(yīng)激與衰老整體實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。

2、項(xiàng)目評估報(bào)價(jià)：公司技術(shù)團(tuán)隊(duì)根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評估項(xiàng)目可行性，與客戶共同確定準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)價(jià)格。嘉美實(shí)驗(yàn)協(xié)助設(shè)計(jì)的課題直接給出準(zhǔn)確的報(bào)價(jià)。

3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費(fèi)用，做好實(shí)驗(yàn)初步準(zhǔn)備及項(xiàng)目預(yù)安排。

4、執(zhí)行服務(wù)項(xiàng)目：正式啟動實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，全面展開實(shí)驗(yàn)，確保項(xiàng)目有效執(zhí)行。

5、溝通項(xiàng)目進(jìn)展：及時(shí)溝通反饋實(shí)驗(yàn)的Newest進(jìn)展，隨時(shí)了解掌控實(shí)驗(yàn)的Newest動態(tài)。

6、完成項(xiàng)目交付：支付剩余尾款，交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正確應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供售后服務(wù)。

 
一、氧化應(yīng)激與衰老介紹
 

 1、衰老是機(jī)體代謝過程中一個進(jìn)行性的必然階段，是機(jī)體健康水平和維持自身內(nèi)穩(wěn)態(tài)能力的退行性改變，表現(xiàn)為機(jī)體對環(huán)境的適應(yīng)能力減弱以致喪失。衰老始于機(jī)體發(fā)育成熟并獲得繁殖能力之后，伴隨著機(jī)體老化，組織器官功能逐漸衰退，死亡的概率增加。一般認(rèn)為人的高壽限大約為120歲。

2、衰老是一個多環(huán)節(jié)的生物學(xué)過程，是多因素共同作用的結(jié)果，其機(jī)制頗為復(fù)雜，涉及到機(jī)體各個系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的改變。這些改變可以增加生物死亡的概率，同時(shí)也往往伴隨疾病的發(fā)生。目前還沒有一種理論能解釋所有的衰老現(xiàn)象。有關(guān)衰老的理論頗多，如遺傳控制理論、體細(xì)胞突變理論、神經(jīng)內(nèi)分泌理論、免疫理論、生活速率理論、生殖與老化理論以及氧化應(yīng)激理論等。盡管關(guān)于衰老有許多假說不斷被提出，但導(dǎo)致生物體增齡性功能改變和壽命改變的機(jī)制仍不明確，其中大多理論都是建立在生物體內(nèi)在衰老重要作用的基礎(chǔ)之上，而環(huán)境因素對衰老的發(fā)生發(fā)展同樣不容忽視。環(huán)境因素既包括生物體外部環(huán)境也包括生物體內(nèi)部環(huán)境。氧化應(yīng)激理論的提出即是考慮了環(huán)境因素對衰老的影響。

3、衰老的自由基理論同時(shí)涵蓋了損傷積累衰老理論和基因程序衰老理論。核心觀點(diǎn)包括以下幾點(diǎn)：①細(xì)胞代謝過程中不斷產(chǎn)生的自由基造成的細(xì)胞損傷是引起機(jī)體衰老的根本原因之一。②造成細(xì)胞損傷的自由基主要是氧自由基，而大部分的活性氧基團(tuán)（ROS）主要由線粒體產(chǎn)生，線粒體作為細(xì)胞呼吸和氧化的中心與衰老密切相關(guān)。③在體內(nèi)維持適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┖妥杂苫宄齽┛梢匝娱L壽命和延緩衰老。

4、機(jī)體在遭受有害刺激時(shí)，體內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生過多，超出了機(jī)體的清除速度，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，過剩的ROS參與細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，引起氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激通過損傷DNA使維持細(xì)胞基本生理功能的基因失去表達(dá)活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老，從而導(dǎo)致組織損傷。在生物體的衰老過程中，機(jī)體組織細(xì)胞不斷產(chǎn)生的自由基逐漸累積，由于自由基反應(yīng)能力較強(qiáng)，可氧化細(xì)胞中的多種物質(zhì)，損傷生物膜，造成蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，因而影響其正常功能。此后自由基學(xué)說被HelmutSies等發(fā)展為“氧化應(yīng)激假說”，該學(xué)說認(rèn)為衰老過程中機(jī)體抗氧化成分的減少導(dǎo)致清除自由基的能力減弱，進(jìn)而導(dǎo)致生物大分子結(jié)構(gòu)損傷的增齡性累積。人體可以被理解成一個氧化與抗氧化的系統(tǒng)，隨著年齡增加，自由基不斷累積，機(jī)體平衡被打破，傾向氧化，進(jìn)而導(dǎo)致了疾病與衰老。盡管以上學(xué)說存在爭議，但近年來越來越多的研究證實(shí)生物大分子的氧化與癌癥、心腦血管疾病、腎病、糖尿病、帕金森病、阿爾茲海默病等衰老相關(guān)疾病以及衰老本身密切相關(guān)，氧化應(yīng)激即便不是諸多疾病的病因，也是一個重要的危險(xiǎn)因素。

5、衰老的氧化應(yīng)激理論認(rèn)為，活性氧造成的DNA損傷是衰老的誘發(fā)事件。在衰老過程中一方面自由基的生成速率可能增加，另一方面機(jī)體氧化與抗氧化水平失衡。氧化應(yīng)激對DNA的氧化損傷在正常代謝狀況下以很高的頻率發(fā)生，氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷易發(fā)生的部位是堿基中的胸腺嘧啶和鳥嘌呤。
6、近來一種新的漸進(jìn)性的ROS衰老理論被提出：衰老早期階段，衰老相關(guān)的DNA損傷產(chǎn)生低劑量ＲOS，由于體內(nèi)的抗氧化體系這些ＲOS并不會引起機(jī)體損傷，反而會觸發(fā)機(jī)體保護(hù)性的壓力應(yīng)激反應(yīng)，延緩衰老。當(dāng)年齡增加，衰老相關(guān)的DNA損傷在體內(nèi)持續(xù)聚集，ROS大量產(chǎn)生，超過了機(jī)體的清除能力，這些蓄積的ROS進(jìn)一步造成DNA損傷，加劇衰老相關(guān)性DNA損傷，加速細(xì)胞的衰老，造成惡性循環(huán)。

二、氧化應(yīng)激與自由基的聯(lián)系

 1、氧化應(yīng)激是指機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下，體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）所引起的細(xì)胞和組織的生理和病理反應(yīng)。ROS有超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH-）和過氧化氫（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和過氧亞硝酸鹽（ONOO-）等等。

2、自由基的危害與作用
  1）危害：它們可以直接或間接氧化或損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，可誘發(fā)基因的突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，被認(rèn)為是人體衰老和各種重要疾病如腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病（老年癡呆）、糖尿病------主要的危險(xiǎn)因子，是人類健康的大敵！
  2）作用：生物氧化，氧化還原反應(yīng)是人體基本的生化反應(yīng)，氧化應(yīng)激亦是人體一種基本的保護(hù)機(jī)制。在我們體內(nèi)，每一個細(xì)胞一天要產(chǎn)生2.5X1011個分子的ROS，人體內(nèi)每天可產(chǎn)生4X1021個分子的自由基。它們不僅為我們提供和傳遞為維持生命活動的能量，幫助我們消滅細(xì)菌和病原體，清除體內(nèi)的毒素和“垃圾”。所以氧化應(yīng)激和自由基亦是我們的朋友我們?nèi)梭w不能沒有，也不能“消滅”它！
  3）簡述抗氧化系統(tǒng)中一些簡單的自由基清除劑及產(chǎn)物
   （1）超氧化歧化酶（SOD），SOD它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因?yàn)樽杂苫斐傻膶?xì)胞傷害。

   （2）過氧化氫酶（CAT），CAT它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，因?yàn)镠2O2會與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的-OH。
   （3）谷胱甘肽過氧化酶（GSH－Px），GSH-Px它為生物體中清除過氧化氫和其他有機(jī)過氧化物的脫毒酶以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用
   （4）丙二醛（MDA），MDA是自由基發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物，促進(jìn)機(jī)體衰老。生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，這回會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性 。

三、氧化應(yīng)激的相關(guān)檢測方法
1、抗氧化酶類的檢測
  1）超氧化物歧化酶(SOD)的檢測
  SOD活力的高低與自由基、低密度脂蛋白的氧化損傷有著密切的聯(lián)系,測定SOD的活力可間接反應(yīng)組織細(xì)胞抗氧化損傷、機(jī)體清除自由基的能力。SOD體外活性測定方法有直接法和間接法,包括電泳法、免疫法、ESR法、化學(xué)發(fā)光法、脈沖輻解法、紫外分光光度計(jì)法等。
  2）谷胱甘肽過氧化物酶的測定 
  谷胱甘肽過氧化物酶催化GSH氧化生成GSSG,用掉一個過氧化氫。在氧化應(yīng)激條件下,細(xì)胞中過氧化氫濃度明顯減少,因此測定GSH過氧化物酶的活力可以作為衡量細(xì)胞抗氧化水平的一項(xiàng)生化指標(biāo)。可采用紫外分光光度計(jì)法、分光光度法或者酶聯(lián)免疫吸附法等進(jìn)行測定。
  3）過氧化氫酶的測定
  過氧化氫酶作用于過氧化氫的機(jī)制實(shí)質(zhì)上是過氧化氫的歧化,必須有兩個過氫化氫先后與過氧化氫酶相遇且碰撞在活性中心上,才能發(fā)生反應(yīng)。過氧化氫濃度越高,分解速度越快。一般也采用紫外分光光度法對其進(jìn)行檢測。

2、脂質(zhì)過氧化損傷的測定
ROS攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,并因此形成脂質(zhì)過氧化,如醛基丙二醛、酮基、羥基氫過氧基以及新的氧自由基等。丙二醛會引起細(xì)胞損傷，因而測定丙二醛的量常常可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映出細(xì)胞損傷的程度。常用硫代*酸法來測定丙二醛含量,此法是應(yīng)用多也是古老的方法。

3、蛋白質(zhì)氧化損傷的檢測
蛋白質(zhì)的氧化損傷不僅包括對酶、受體和載體蛋白的損傷,而且還包括一些二次損傷,如DNA修復(fù)酶的損傷。目前,蛋白質(zhì)氧化使用廣的生物標(biāo)志物是蛋白質(zhì)羰基含量，其傳統(tǒng)的檢測技術(shù)是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶免疫吸附法測定2, 4-二硝基苯肼與蛋白質(zhì)羰基反應(yīng)生成的腙,來衡量蛋白質(zhì)的損傷情況。一般采用Western blotting或者RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）來分析蛋白質(zhì)含量以及蛋白表達(dá)情況。

4、氧化損傷致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的檢測

  1）Bcl-2基因的檢測 
  Bcl-2蛋白的上調(diào)表達(dá)可以對抗細(xì)胞的凋亡,在ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中,Bcl-2發(fā)揮了重要作用，Bcl-2可以減少氧自由基的產(chǎn)生。Bcl-2的過度表達(dá)能阻抑多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。測定方法主要有印跡雜交和實(shí)時(shí)熒光定量法對它進(jìn)行檢測。隨著近年來熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)術(shù)的發(fā)展，用定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)來檢測基因表達(dá)水平無疑比之前者更快更準(zhǔn)確。
  2）p53基因的檢測
  p53基因?qū)僖职┗?是細(xì)胞生長周期中負(fù)調(diào)節(jié)因子,與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA的修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等功能相關(guān)。氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的過程必須有p53參與。常采用免疫組織化學(xué)、原位雜交等方法來檢測。