據(jù)輝駿生物在科研實(shí)驗(yàn)中調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大家在前期調(diào)研中是否經(jīng)常遇到這些問(wèn)題：

1、通過(guò)各種在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)獲得 miRNA 靶向基因，但對(duì) miRNA 靶基因的實(shí)際作用不清楚。

2、預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用，而具體活性以及結(jié)合位點(diǎn)仍然需驗(yàn)證。

3、未知 lncRNA 或者 circRNA 吸附 miRNA 效果。

這時(shí)候需用到螢光素酶（Luciferase）實(shí)驗(yàn)了。

輝駿生物介紹下熒光素酶的2個(gè)應(yīng)用：

1：pGL3-Basic——用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動(dòng)子活性分析。

當(dāng)我們把待分析的啟動(dòng)子區(qū)段構(gòu)建到 F-Luciferase 上游，和轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)染分析 F-Luciferase 活性即可反應(yīng)啟動(dòng)子的活性高低。該質(zhì)粒通常需要結(jié)合持續(xù)性表達(dá) R-Luciferase 的載體作為內(nèi)參以校正不同樣品之間轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。

啟動(dòng)子的作用相當(dāng)于「基因開(kāi)關(guān)」，能夠控制基因表達(dá)的起始。而啟動(dòng)子的活性受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。一些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。螢光素酶報(bào)告基因分析（luciferase assay）是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段。

將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到報(bào)告基因質(zhì)粒中螢光素酶編碼序列的 5』端，再與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入特定的螢光素酶底物，通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定螢光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法則可進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子與靶標(biāo)啟動(dòng)子的作用。

2、psiCHECK2——用于 miRNA 與其靶點(diǎn)相關(guān)分析

包括 miRNA 靶基因驗(yàn)證、lncRNA 與 circRNA 吸附 miRNA 驗(yàn)證等。需要把 miRNA 潛在結(jié)合靶點(diǎn)克隆到 R-Luciferase (hRLuc) 3』UTR 區(qū)域，然后與待測(cè) miRNA 共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)測(cè)定 R-Luciferase 活性高低，F(xiàn)-Luciferase（hLuc+）作為校正內(nèi)參和不同樣品之間轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。

miRNA 通常功能性作用于靶基因 3'UTR，因此可以將目的基因 mRNA3'UTR 序列插入載體 R-Luciferase (hRLuc) 3'UTR 區(qū)域， 通過(guò)比較 miRNA 引起的 R-Luciferase 活性高低來(lái)定量檢測(cè) miRNA 對(duì)目的基因的抑制作用；結(jié)合定點(diǎn)突變等方法則可進(jìn)一步確定 miRNA 對(duì)靶基因 3'UTR 的直接靶向序列。

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1、靈敏度高，無(wú)內(nèi)源性干擾；

2、檢測(cè)范圍寬，大于7個(gè)數(shù)量級(jí)；

3、檢測(cè)速度快，樣本無(wú)須孵育等預(yù)處理；

4、操作簡(jiǎn)便，可以在同一管內(nèi)完成2個(gè)熒光素酶檢測(cè)。

客戶提供-輝駿生物

1、miRNA表達(dá)載體或miRNA mimics

2、預(yù)測(cè)靶基因非翻譯區(qū)的載體和序列

交付產(chǎn)物

1、構(gòu)件號(hào)載體質(zhì)粒和甘油菌

2、熒光素酶檢測(cè)原始數(shù)據(jù)

3、數(shù)據(jù)分析結(jié)果實(shí)驗(yàn)

mirRNA靶基因?qū)嶒?yàn)周期及費(fèi)用-輝駿生物

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