PCR原理及故障維修電話擴(kuò)增的原理和操作步驟（一）

Thermo PCR擴(kuò)增反應(yīng)的操作

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1   Thermo PCR擴(kuò)增反應(yīng)的基本原理

一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基本構(gòu)成

PCR原理及故障維修電話是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱，指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定模板(克隆或基因組DNA)的擴(kuò)增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，在體外特異性擴(kuò)增DNA pian段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。

 Thermo PCR基本原理: 是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3'末端有引物存在的情況下，用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴(kuò)增。在微量離心管中，加入與待擴(kuò)增的DNA pian段兩端已知序列分別互補(bǔ)的兩個引物、適量的緩沖液、微量的

2+DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq DNA聚合酶、Mg等。反應(yīng)時先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態(tài);然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對，形成部分雙鏈，稱為退火;再將溫度升至合適溫度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿5'?3'方向延伸，形成新的DNA 段，該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此重復(fù)改變溫度，由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個周期，反復(fù)循環(huán)，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。因此PCR循環(huán)過程為三部分構(gòu)成:模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DNA鏈延伸合成(見圖)。

1(模板DNA的變性

模板DNA加熱到90~95?時，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，稱為DNA的變

G-C間由三個性，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。變性溫度與DNA中G-C含量有關(guān)，氫鍵連接，而A-T間只有兩個氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時間與模板DNA的二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。對于高G-C含量的模板DNA在實驗中需添加一定量二甲基亞砜(DMSO)，并且在PCR循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97?，時間適當(dāng)延長，即所謂的熱啟動。

2(模板DNA與引物的退火

將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65?時，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復(fù)合物。退火所需要的溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并由于引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時，引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多，退火時間一般為1,2min。

3(引物的延伸

DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。在72?條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40,60個堿基/秒。經(jīng)過一輪“變性-退火-延伸”循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一輪循環(huán)以后，DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個循環(huán)需2,4min，一次PCR經(jīng)過30,40次循環(huán)，約2,3h。擴(kuò)增初期，擴(kuò)增的量呈直線上升，但是當(dāng)引物、模板、聚合酶達(dá)到一定比值時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，便出現(xiàn)所謂的“平臺效應(yīng)”，即靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加。

Thermo PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)終的DNA擴(kuò)增量可用Y

n,(1，X)計算。Y代表DNA pian段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，

靶序列DNA pian段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA pian段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。

Thermo PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在di一個反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA pian段供分析與檢測用。

變性

退火

延伸

圖 Thermo PCR的反應(yīng)歷程