葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基（又名葉酸干酪培養(yǎng)基）采用鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）為測(cè)定用菌，用于葉酸的微生物法測(cè)定。該培養(yǎng)基是基于Flynn等人(1)的配方，并經(jīng)Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于維生素測(cè)定的培養(yǎng)基通常需要三種：維持培養(yǎng)基、接種培養(yǎng)基和測(cè)定用培養(yǎng)基。后者通常是化學(xué)限定的培養(yǎng)基，包含所有測(cè)定菌生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，但不含有待測(cè)的分子。類似的，葉酸干酪培養(yǎng)基包含鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)所需的所有成分，但不包含葉酸。因而，添加一系列濃度增加的葉酸，會(huì)觀察到鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的遞增。

       鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）的貯備菌制備是在AOAC推薦的乳桿菌瓊脂（貨號(hào)M366）試管穿刺接種培養(yǎng)，35-37°C孵育18-24小時(shí)后，試管儲(chǔ)存在冰箱里。每月轉(zhuǎn)接一次。測(cè)定菌液的制備是將貯備菌轉(zhuǎn)種到含10ml微量維生素檢測(cè)接種肉湯（貨號(hào)M133）或乳酸桿菌肉湯（貨號(hào)M367）的試管中。35-37°C孵育24小時(shí)后，在無(wú)菌條件下菌液離心，棄掉上清，再重懸于10ml的無(wú)菌葉酸干酪培養(yǎng)基中（貨號(hào)M543）。再像之前一樣沉淀，并清洗一次。最后，清洗后的菌株重懸于10ml葉酸干酪培養(yǎng)基中，并用該培養(yǎng)基進(jìn)行1:100稀釋。1滴重懸液用于接種到每個(gè)測(cè)定管中。也可用0.85% NaCl代替培養(yǎng)基來(lái)清洗和稀釋。

       由于滅菌條件，孵育溫度等因素會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)，并且每次不會(huì)*一樣，因此每次都應(yīng)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。10ml管內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品量為0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。

       葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將20mg葉酸干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸餾水中。用0.1N NaOH調(diào)整溶液pH值為10.0，再用0.05N HCl調(diào)pH為 7.0。該溶液含有200mg葉酸/ml。用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，則濃度為200ng/ml。再用999ml葉酸緩沖液A（貨號(hào)M544）稀釋1ml該溶液，則為0.2ng/ml的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。每管取0,0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml該溶液，配置即告完成。

       樣本葉酸濃度的測(cè)定步驟：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的制備好的血清提取物。加入5ml葉酸干酪培養(yǎng)基和足量的蒸餾水，使每個(gè)試管的總體積為10ml。15磅121°C滅菌5分鐘。冷卻試管并向每個(gè)試管中加入一滴接種液。35-37℃孵育18-24小時(shí)后進(jìn)行濁度讀數(shù)。讀數(shù)前將試管冷藏15-30分鐘以停止細(xì)菌生長(zhǎng)。620nm檢測(cè)吸光度。待測(cè)樣品中的葉酸含量應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定，不過(guò)要考慮樣品稀釋度。

       應(yīng)非常小心，避免培養(yǎng)基和玻璃器具被污染。應(yīng)使用潔凈的無(wú)去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

應(yīng)用　　

葉酸干酪培養(yǎng)基用于葉酸的微生物法測(cè)定。鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）為測(cè)定用菌。

質(zhì)量控制　　　

 ?外觀——米黃色至黃色均一自由流動(dòng)粉末

 ?制備好的培養(yǎng)基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀

 ?配比濃度——在25°C下9.4%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.7±0.1

 ?pH值——6.60-6.80

配置　　

   稱取9.4g干粉培養(yǎng)基溶于100ml蒸餾水，加入50mg抗壞血酸。加熱至沸騰使培養(yǎng)基*溶解。測(cè)定時(shí)，分裝至每管為5ml培養(yǎng)基（包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）。加蒸餾水，使總體積達(dá)到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻。

培養(yǎng)反應(yīng)　　

采用鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）進(jìn)行葉酸的微生物法測(cè)定。35-37°C孵育16-18小時(shí)。

生長(zhǎng)狀況　　

   可獲得良好的生長(zhǎng)。隨著測(cè)定管葉酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度升高（即 0, 0.1,0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1ng），鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。

參考文獻(xiàn)　　

1. Flynn,Williams, ODell and Hogan, 1951, Anal. Chem., 23, 180.

2. Baker, Herbert,Frank, Pasher, Hunter, Wasserman and Sobotka, 1959,Clin. Chem., 5, 275.

3. Waters and Mollin,1961, J. Clin. Path., 14, 335.

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