人紅細(xì)胞刺激因子使用目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本紅細(xì)胞刺激因子（ESF）含量。

　　試驗原理：ESF試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知ESF濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將ESF和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中ESF的濃度呈比例關(guān)系。

　　自備材料

　　1．蒸餾水。

　　2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

　　3．振蕩器及磁力攪拌器等。

　　安全性

　　1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

　　2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

　　3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

　　操作注意事項

　　1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

　　2．實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

　　3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

　　4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

　　5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

　　6．洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

　　7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

　　8．入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

　　9．按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

　　人紅細(xì)胞刺激因子的樣品收集、處理及保存方法

　　1、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

　　2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

　　3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

　　5、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　試劑的準(zhǔn)備

　　1．準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

　　80ng/ml（6號標(biāo)準(zhǔn)品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

　　40ng/ml（5號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　20ng/ml（4號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　10ng/ml（3號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　5.0ng/ml（2號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　2.5ng/ml（1號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　0ng/ml（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

　　2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

　　操作步驟

　　1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

　　2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

　　3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

　　4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

　　5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

　　6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

　　7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

　　8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

　　9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

　　試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被V-生育酚（v-Tocopherol）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的V-生育酚（v-Tocopherol）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。