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Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實時熒光定量PCR儀器入門指南：相對定量測定

貨號：4347824

實時熒光定量PCR（qPCR）作為分子生物學研究中的一種強大工具，已廣泛應用于基因表達分析、病原體檢測、基因分型和藥物篩選等多個領域。賽默飛世爾科技旗下的Applied Biosystems™ 7300 和 7500系列實時熒光定量PCR儀器，憑借其出色的性能、簡便的操作和強大的數(shù)據(jù)分析能力，成為眾多實驗室和研究機構的。本文將為您詳細介紹這兩款儀器，并著重講解其在相對定量測定中的應用。

一、Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實時PCR儀器概述

Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實時PCR儀器是專為滿足不同規(guī)模實驗室需求設計的高性能設備。它們均集成了多通道熒光檢測、精準溫度控制和直觀的數(shù)據(jù)分析軟件，能夠幫助科研人員進行快速、準確的核酸定量分析。

1.1 7300 和 7500 系列的區(qū)別

• 7300 實時熒光定量PCR儀器：7300型號為中小規(guī)模實驗室設計，適合需要中等通量的研究。其系統(tǒng)采用96孔板，適合常規(guī)實驗的定量分析。

• 7500 實時熒光定量PCR儀器：7500系列與7300的主要區(qū)別在于其優(yōu)化的速度和靈活性，能夠在更短的時間內(nèi)完成PCR反應。7500可用于高通量實驗，擁有更強的處理能力，特別適用于時間要求較高的實驗室。

二、Thermo賽默飛實時熒光定量PCR儀器4347824：核心技術與特點

Applied Biosystems™ 7300 和 7500 系列實時熒光定量PCR儀器采用的核心技術確保了實驗數(shù)據(jù)的高靈敏度、準確性和重現(xiàn)性。以下是其幾大核心技術優(yōu)勢：

2.1 多通道熒光檢測

這兩款儀器均配備了多通道熒光檢測系統(tǒng)，7300 配有四通道檢測能力，而7500系列擁有五通道熒光檢測功能。多通道熒光檢測允許用戶在同一個反應體系中檢測多種目標基因，實現(xiàn)多重PCR的應用。多重檢測極大地提高了實驗的通量，同時節(jié)省了樣本量和反應時間。

2.2 精確的熱循環(huán)系統(tǒng)

PCR反應的關鍵在于精確的熱循環(huán)控制。Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實時PCR儀器內(nèi)置高精度溫度控制模塊，確保每個PCR反應循環(huán)中的溫度變化均一且穩(wěn)定，減少了因溫度波動造成的實驗偏差，從而提高了PCR反應的重復性和可靠性。

2.3 用戶友好的操作界面

這兩款儀器均配備直觀易用的軟件界面，操作流程簡便。其專屬的qPCR軟件能夠自動化分析實驗數(shù)據(jù)，支持多種分析模式，如絕對定量、相對定量、SNP分析和基因分型。即使是新手實驗人員，也能夠迅速掌握儀器操作流程，完成數(shù)據(jù)采集與分析。

2.4 兼容多種化學試劑

7300 和 7500 系列儀器均支持多種熒光染料和探針化學試劑，如SYBR Green、TaqMan探針和分子信標。這種廣泛的兼容性為用戶提供了高度靈活性，能夠根據(jù)具體實驗需求選擇最佳的試劑和反應方案。

三、相對定量測定中的應用

相對定量PCR是一種廣泛應用于基因表達分析的方法，通過與內(nèi)參基因的比較來確定目標基因的相對表達水平。以下是Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實時PCR儀器在相對定量測定中的應用方法和流程。

3.1 相對定量的原理

相對定量測定基于△△Ct方法（雙重循環(huán)閾值比較法），其中Ct值代表PCR擴增達到熒光信號閾值所需的循環(huán)數(shù)。通過比較目標基因與內(nèi)參基因的Ct值差異，可以計算目標基因在不同實驗條件下的相對表達水平。

相對定量的計算公式為：

$$\text{相對表達量} = 2^{-\Delta \Delta Ct}$$

其中：

• $\Delta Ct = Ct_{\text{目標基因}} - Ct_{\text{內(nèi)參基因}}$

• $\Delta \Delta Ct = \Delta Ct_{\text{實驗組}} - \Delta Ct_{\text{對照組}}$

該方法能夠精準反映基因表達在不同實驗條件下的變化，適用于比較多個樣本或實驗條件下的基因表達差異。

3.2 實驗步驟

1. 樣本準備

在相對定量PCR實驗中，首先需要從實驗樣本（如組織或細胞）中提取高質(zhì)量的RNA，然后通過逆轉錄反應將RNA轉化為cDNA。為了確保實驗結果的準確性，RNA樣本必須保持純凈，避免蛋白質(zhì)、DNA或有機溶劑的污染。

2. qPCR反應體系配置

使用Applied Biosystems™ 7300 或 7500儀器，qPCR反應體系通常包括：

• 目標基因和內(nèi)參基因的引物

• cDNA模板

• 熒光探針（如TaqMan探針）或SYBR Green染料

• PCR酶和緩沖液

確保引物設計合理，能夠特異性擴增目標基因和內(nèi)參基因的片段，同時引物退火溫度優(yōu)化到最佳，以提高反應的擴增效率。

3. 設置實驗條件

在Applied Biosystems™ 7300 或 7500系統(tǒng)中，用戶可以輕松設置PCR循環(huán)參數(shù)，包括預變性、退火和延伸步驟。根據(jù)具體實驗的優(yōu)化情況調(diào)整退火溫度和循環(huán)次數(shù)，確保高效的擴增。

4. 數(shù)據(jù)采集與分析

qPCR反應完成后，系統(tǒng)會自動生成Ct值。通過內(nèi)置的軟件，用戶可以輕松地利用△△Ct方法進行相對定量分析。數(shù)據(jù)分析過程中，需確保內(nèi)參基因的Ct值在不同樣本間保持相對穩(wěn)定，才能確保相對定量結果的準確性。

3.3 數(shù)據(jù)標準化與內(nèi)參基因選擇

在相對定量PCR實驗中，數(shù)據(jù)標準化是非常關鍵的一步。通常使用內(nèi)參基因來校正樣本間的差異，常見的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-Actin和18S rRNA等，這些基因在不同實驗條件下的表達通常保持穩(wěn)定。在進行實驗設計時，選擇適合的內(nèi)參基因能夠顯著提高相對定量結果的準確性。

四、Thermo賽默飛實時熒光定量PCR儀器4347824：應用實例

4.1 基因表達研究

在基因表達分析中，Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實時PCR系統(tǒng)被廣泛應用于檢測特定基因在不同組織、發(fā)育階段或實驗條件下的表達水平。例如，在癌癥研究中，科研人員可以利用這些儀器分析腫瘤組織中與癌癥相關基因的表達變化，揭示潛在的分子機制。

4.2 病原體檢測

7300 和 7500 系列儀器在病原體檢測方面表現(xiàn)優(yōu)異，尤其是在病毒或細菌核酸檢測中。相對定量方法能夠幫助臨床研究人員量化病原體的感染水平，為疾病診斷和防控提供有力的支持。

4.3 藥物篩選與毒性評估

在藥物篩選過程中，研究人員經(jīng)常使用7300 和 7500 實時PCR系統(tǒng)分析藥物處理后細胞中基因表達的變化，以評估藥物的效果和毒性。這種應用尤其適用于高通量篩選研究，通過多重qPCR檢測多個基因，快速評估藥物對不同基因的調(diào)控作用。

五、優(yōu)勢與應用前景

5.1 高靈敏度與高特異性

Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實時PCR系統(tǒng)的高靈敏度能夠檢測到微量的核酸，并精確量化其表達水平。這在分析低豐度基因表達時尤為重要，能夠提供可靠的實驗結果。

5.2 多重檢測與高通量應用

多重熒光檢測功能使得7300 和 7500 系列能夠在一次反應中同時檢測多個基因，大大提高了實驗效率，減少了樣本和試劑的用量。