產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

物葉綠體是重要的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)光合作用，具有獨(dú)立的基因組 DNA 和獨(dú)立的 RNA 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，是重要的研究材料。本試劑盒專門用于植物葉綠體 RNA 的快速提取。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.純度高，不含污染和抑制劑。

2.得到的葉綠體 RNA 可以直接用于 RT-PCR 等后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3.植物葉綠體RNA純化試劑盒足夠 15 次提取，每次可處理 30g 葉片。

4.已經(jīng)成功用于菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等雙子葉植物，也適用于單子葉等其他植物（可能需要優(yōu)化條件）。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

15次

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存，但葉綠體純化勻漿液成分二需要。保存期限一年。本試劑盒提供的葉綠體純化勻漿液成分二需要塑料袋包裝，低溫運(yùn)輸，-20℃保存。

自備試劑

去離子水、Waring 勻漿機(jī)、75%乙醇

使用方法：

注意：葉綠體對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。離心時(shí)一定要在 4℃進(jìn)行，離心力以 g 而不是 rpm 計(jì)算。如果需要研究葉綠體的功能，提取還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。強(qiáng)烈建議用顯微鏡監(jiān)控整個(gè)過程中葉綠體的回收情況。

一：葉綠體的純化

1.實(shí)驗(yàn)前 1-2 天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時(shí)這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實(shí)驗(yàn)前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時(shí)需要保持葉片濕潤(rùn)，即使如此，葉片的放置時(shí)間也不能超過一天。

2.計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需勻漿液的體積。本試劑盒一次實(shí)驗(yàn)可處理 30 g 葉片，對(duì)一般植物，每克葉片需要準(zhǔn)備 4mL 勻漿液，則一次實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備 120mL 勻漿液。對(duì)煙草和大豆，每克葉片需要 6mL 勻漿液，則一次實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備 180mL 勻漿液。為了保險(xiǎn)最好可以多配 10%。

3.實(shí)驗(yàn)當(dāng)天制備勻漿液。制備方法是：將自備的去離子水與葉綠體純化勻漿液成分一在干凈的玻璃或塑料容器中按 4：1 的比例混合，然后在每 100 mL 混合液中加入勻漿液成分二干粉 0.1g（終濃度為 0.1%），輕柔攪拌 10 分鐘后，所得溶液即為勻漿液。冰上預(yù)冷待用。勻漿液只能當(dāng)天使用，不能放置。

4.預(yù)留 1.5mL 勻漿液用于懸浮葉綠體，其余勻漿液轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)）中，再快速將新鮮植物葉片的葉脈去除，再將葉片剪成1-3 cm2 大小的碎片，浸泡在勻漿機(jī)里面的勻漿液中。注意：理論上可用Dounce 玻璃勻漿器，Polytron 勻漿機(jī)和研磨（加玻璃珠）等勻漿，但它們單次處理量小，需分成很多份處理后再匯集，非常不方便，故建議使用 Waring勻漿機(jī)。

5.低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的葉碎片按入到勻漿機(jī)底部， 再低速勻漿 10 秒。

6.用試劑盒提供的帶柄尼龍濾篩過濾勻漿液，用預(yù)冷的 200 mL 量筒收集穿透液， 再等分到 4 個(gè)預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個(gè)管中的穿透液不要超過 35 mL）。帶柄尼龍濾篩洗滌干凈后可反復(fù)使用。

7.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 200 g 離心 3 分鐘（對(duì)菠菜，白菜和萵筍材料）或400 g 離心 1 分鐘（對(duì)甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細(xì)胞或細(xì)胞核。其他植物材料則需要用戶自己摸索最佳離心力。

8.將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的、預(yù)冷的 50 mL 塑料離心管中。

9.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體。

10.在沉淀中加入第 4 步預(yù)留的 1.5 mL 預(yù)冷勻漿液，用軟毛筆使葉綠體重懸，如果有白色淀粉沉淀，重懸時(shí)避免重懸白色淀粉。注意：重懸時(shí)不能要用槍頭吹打，否則葉綠體容易破裂。

11.將 4 管葉綠體重懸液匯集（共約 6 mL），得到葉綠體粗提液。

12.如果對(duì)葉綠體 RNA 是否含 DNA 污染的要求不高，則葉綠體粗提液可以直接用于葉綠體 RNA 純化，具體操作是在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀為葉綠體，直接用于 RNA 純化（見第二步）。

13.如果需要無細(xì)胞核 DNA 污染的葉綠體 RNA，則按以下流程操作：在 50 mL 塑料離心管中先加入 6 mL 勻漿液成分一和 4 mL 的 Percoll，充分混合均勻得到 40%的 Percoll 溶液，在其液面上小心鋪上 6mL 的葉綠體粗提液，在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1700 g 離心 6 分鐘，管底綠色沉淀為完整的葉綠體，液面的綠色部分為破碎的葉綠體。小心將上清去除后，直接將沉淀（完整葉綠體） 用于葉綠體 RNA 純化（見第二步）。

二：葉綠體 RNA 的純化

14.將 1mL 細(xì)胞器 RNA 純化溶液A 加入到葉綠體沉淀中后充分吹打混勻。

15.加入 0.2mL 細(xì)胞器 RNA 純化溶液 B，震蕩混勻 10-30 秒。

16.室溫放置 5 分鐘。

17.14,000 rpm 室溫離心 3 分鐘。

18.小心轉(zhuǎn)移上清液（約 0.7mL）到一個(gè)新的 1.5 mL 離心管中。

19.加入等體積的細(xì)胞器 RNA 純化溶液 C，顛倒混勻后 14,000 rpm 室溫離心 10分鐘。

20.小心棄上清液。

21.在沉淀中加入自備的 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻。

22.14,000 rpm 室溫離心 3 分鐘，棄上清液。

23.空甩半分鐘 n 去除殘留液體約 50uL。

24.室溫開蓋放置 2-3 分鐘。

25.加入 30uL RNA 洗脫液吹打溶解 RNA 沉淀，取 uL 在 NanoDrop 上測(cè) OD， 計(jì)算濃度和回收率，然后立即進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或?qū)?RNA 放-80℃保存。

選擇我們的植物葉綠體RNA純化試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！