產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是在本公司血液 DNA 提取產(chǎn)品基礎(chǔ)上開發(fā)的、專門用于從新鮮或冷凍的人抗凝全血中提取線粒體 DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）的試劑。人血液中的細(xì)胞分類如下：

人血液中紅細(xì)胞與白細(xì)胞的數(shù)量比例為 1000-6000：1，但紅細(xì)胞中沒有 DNA，故所提線粒體 DNA 主要來源于白細(xì)胞。白細(xì)胞分多型核白細(xì)胞（Polymorphonuclear Leukocytes，PMNs）和外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells， PBMCs）兩類細(xì)胞，前者包括占白細(xì)胞總數(shù) 50-70%的中性粒細(xì)胞 Neutrophils，0.5-5%的嗜酸性粒細(xì)胞 Eosinophils 和 0-1%的嗜堿性粒細(xì) Basophils。后者包括占白細(xì)胞總數(shù) 20- 40%的淋巴細(xì)胞Lymphocyte（T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞），1-8%的單核細(xì)胞Monocyte和 0.3-0.9%的樹突狀細(xì)胞 Dendritic Cell。

產(chǎn)品特點：

1. DNA 產(chǎn)率高。如果樣本為新鮮血液，線粒體 DNA 產(chǎn)率最高可以達(dá)到 1 ?g/mL 新鮮血液。如果樣本為凍存血液，DNA 產(chǎn)率差別較大。

2. DNA 純凈，OD260/OD280 在 1.8-2.0 之間。

3.可直接用于 PCR、酶切、雜交等實驗。

4.適用于哺乳動物血液，不適用于其他動物血液。

5.本產(chǎn)品足夠使用 50 次，每次可以處理 3 mL 抗凝血液。

6.每 1E7 個白細(xì)胞可以純化到 40-80 ng mtDNA。

7.血液線粒體 DNA-提取試劑盒（沉淀法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成分編號規(guī)格包裝

10×紅細(xì)胞裂解液（DNA 純化用）15 mL15 mL 本色瓶

凍存血液紅細(xì)胞裂解液（DNA 純化用）250 mL×2250 mL 本色瓶

白細(xì)胞洗滌液100 mL125 mL 本色瓶

線粒體 DNA 提取溶液 A7.5 mL10 mL 本色瓶

線粒體 DNA 提取溶液 B15 mL15 mL 棕色瓶

線粒體 DNA 提取溶液 C12 mL15 mL 本色瓶

去蛋白溶液50 mL60 mL 棕玻瓶

微量核酸沉淀劑（IPA 型）50 mL60 mL 本色瓶

DNA 洗脫液（基因組純化專用）10 mL10 mL 本色瓶

使用手冊1 份無

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存，保存期限一年。

自備試劑

1.5 mL 塑料離心管，75%乙醇。

使用方法：

一、新鮮血液白細(xì)胞的分離

本試劑盒只提供基于全血紅細(xì)胞裂解法的白細(xì)胞制備試劑。由于有很多方法（如自然沉降法、差異沉淀法、Ficoll 分離法，氯化銨分離法等）從新鮮抗凝血液制備白細(xì)胞，因此用戶可以用自選的方法制備白細(xì)胞。如果選擇用自備試劑制備白細(xì)胞，則本步操作可以跳過。

1.將 3 mL 人新鮮抗凝血液轉(zhuǎn)移到一個干凈的 15 mL 塑料離心管中。

2.按照 10：1 的比例加入 0.3 mL10×紅細(xì)胞裂解液（DNA 純化用）使其終濃度為 1×；輕柔顛倒數(shù)次混勻，靜置 10 分鐘（期間可輕柔顛倒混勻幾次）。注意：紅細(xì)胞裂解液（DNA 純化用）一旦打開后，非常容易污染細(xì)菌，未用完的部分最好-20℃保存，下次使用前，要溶解后充分搖勻。

3.室溫下 500×g 離心 8 分鐘沉淀白細(xì)胞核。上清將呈現(xiàn)紅色，這是紅細(xì)胞裂解后釋放出血紅蛋白的顏色。棄上清。

4.在沉淀中加入 1 mL 的白細(xì)胞洗滌液，輕柔重懸白細(xì)胞沉淀得到白細(xì)胞重懸液。

5.離心 500×g 8 分鐘，棄上清。在沉淀中加入 1mL 的白細(xì)胞洗滌液，輕柔重懸白細(xì)胞沉淀得到白細(xì)胞重懸液。

6.對白細(xì)胞重懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。由于人白細(xì)胞濃度差異比較大（新生兒童為 15-20×E9 個/L，半歲到 2 歲兒童為 11-12×E9 個/L，4-14 歲為 8×E9 個/L，成人為 4-10×E9 個/L，L 指血液體積），故需要從下步開始使用固定細(xì)胞數(shù)。

7.將 1E7 個白細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 塑料離心管，1500×g 離心 4 分鐘，棄上清，白細(xì)胞將形成沉淀。

8.所得白細(xì)胞沉淀可以直接用于 DNA 提取，也可放置在-20℃待用。

二、線粒體 DNA 的提取

9.在白細(xì)胞沉淀中加 150 ?L 線粒體 DNA 純化溶液A，用移液槍吹打數(shù)次混勻后放冰上。

10.再加入 300 ?L 線粒體 DNA 純化溶液 B，輕柔顛倒混勻 10 次。此溶液為藍(lán)色，混勻后混合液的藍(lán)色將變得均勻。冰上準(zhǔn)確放置 8 分鐘。

11. 再加入 225 ?L 線粒體 DNA 純化溶液 C，輕柔顛倒混勻 10 次，混合液將變成無色。冰上準(zhǔn)確放置 25 分鐘。如果顏色異常，需要停止實驗，分析原因。

12. 在 4℃下 13000×g 離心 20 分鐘。

13.將上清（含線粒體 DNA）轉(zhuǎn)移到一只新的 1.5 mL 塑料離心管中。

14.加入等體積的去蛋白溶液，渦旋震蕩 3 分鐘混勻。

15.室溫 13000×g 離心 5 分鐘，轉(zhuǎn)移無色的水相到一只新的 1.5 mL 塑料離心管中，不要取藍(lán)色的液體。

16.在無色的上清中加入等體積的微量核酸沉淀劑（IPA 型），顛倒 10 次混勻，室溫 13000

×g 離心 10 分鐘，去盡上清，注意不要觸及管底微量沉淀。

17.加入 1 mL 自備的 75%乙醇，充分混勻后室溫 13000×g 離心 3 分鐘，去盡上清，注意不要觸及管底微量沉淀。重復(fù)上步一次。

18.短暫離心，去盡殘留溶液大約 50 ?L（此步十分重要，不要省略）。

19.短暫晾干半分鐘，加入 50 ?L DNA 洗脫液（基因組專用）溶解 DNA。一般能得到 40-80 ng mtDNA。

20.溶解后的 DNA 可以立即用于后續(xù)的 OD 檢測、酶切、PCR 或其他實驗，也可以放置在- 20℃長期保存。如果需要更多mtDNA，可以使用滾環(huán)擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增。

三、凍存血液線粒體 DNA 的純化

21.將凍存血液放 37℃水浴化凍。

22.將 2 mL 抗凝新鮮血液轉(zhuǎn)移到一個干凈的 15 mL 塑料離心管中。

23.加入 4 倍體積（8 mL）的凍存血液紅細(xì)胞裂解液（DNA 純化用），臺式搖床上輕柔搖晃10 分鐘混勻。注意：凍存血液紅細(xì)胞裂解液（DNA 純化用）一旦打開后，非常容易污染細(xì)菌，未用完的部分最好-20℃保存，下次使用前，要溶解后充分搖勻。

24.在 4℃ 1000×g 離心 4 分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中。

25.將上清在 4℃ 12000×g 離心 10 分鐘，棄上清，保留沉淀。

26.接第 7-19 步進(jìn)行線粒體DNA 純化。注意：由于陳舊血液在凍凝過程中冰晶已經(jīng)對細(xì)胞核膜和線粒體膜產(chǎn)生損傷，所以離心得到的白細(xì)胞不能洗滌。同時由于有很多線粒體被冰晶刺破，線粒體 DNA 已經(jīng)流失，故其得率會比新鮮血液線粒體 DNA 少，具體減少多少跟凍凝時間長短有關(guān)。

選擇我們的血液線粒體 DNA-提取試劑盒（沉淀法），就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護(hù)航！