產(chǎn)品簡介：

包涵體（Inclusion Body）是指超表達(dá)的蛋白在宿主細(xì)胞胞漿內(nèi)（如果超表達(dá)的是胞漿蛋白）或膜間內(nèi)（如果超表達(dá)的是分泌蛋白）凝集形成的無活性的固體顆粒。包涵  體形成的主要原因是在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白折疊輔助因子，或環(huán)境不適   導(dǎo)致無法形成正確的蛋白質(zhì)次級鍵。由于包涵體主要由超表達(dá)的重組蛋白質(zhì)組成，因此   分離純化包涵體是分離純化具有活性的重組蛋白的第一步。本產(chǎn)品就是用于快速地從大  腸桿菌宿主中提取高質(zhì)量的包涵體的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.操作簡單快速，整個過程只要三十分鐘左右。

2.微量純化，可以在 1.5mL 離心管中完成。

3.能有效去除包涵體中的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白所占比重達(dá)到 60%以上。

4.主要用于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，也可用于真菌和真核表達(dá)系統(tǒng)，但用戶需要自行摸索條件。

5.可以選擇鹽酸胍和尿素兩種蛋白溶解方式。

6.得到的包涵體溶解液可以用于重折疊、SDS-PAGE 或其他純化處理。

7.微量包涵體純化試劑盒足夠 20 次微量純化。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存、溶菌-酶和 Benzonase 需要低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。無

自備試劑

無

使用方法：

一：超聲法菌

1.在蛋白誘導(dǎo)期結(jié)束時，轉(zhuǎn)移 1.5 mL 菌液到一個干凈的塑料離心管中。最好同時用不加誘導(dǎo)物的細(xì)菌做平行對照實驗。

2.12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，小心棄上清。沉淀（約 10 mg）放冰上待用或放-80℃保存。

3.加入 250 uL 冰浴的包涵體純化溶液 A，冰上超聲裂解菌體直到在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索，但裂解物必須不粘稠，否則不  容易沉淀包涵體。

4.直接進(jìn)入第 14 步。

二：酶法裂菌

5.一次微量提取需要 250uL 包涵體純化溶液 A，用前取包涵體純化溶液 A，按每 mL 加入 120mg 溶菌-酶的比例加入所需量的溶-菌酶并搖晃溶解待用。溶菌-酶的溶液非常容易衰變，所以最好現(xiàn)配現(xiàn)用，沒用完的只能在-20℃放一周。

6.包涵體中的重組蛋白一般比溶解狀態(tài)中的蛋白質(zhì)更能夠抵抗微量內(nèi)源性蛋白水解  酶的降解，但如果實驗發(fā)現(xiàn)得到的重組蛋白確有降解，則需要在包涵體純化溶液 A 中新鮮加入自備的蛋白酶抑制劑混合物。

7.在蛋白誘導(dǎo)期結(jié)束時，轉(zhuǎn)移 1.5 mL 菌液到一個干凈的塑料離心管中。最好同時用不加誘導(dǎo)物的細(xì)菌做平行對照實驗。

8.12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，小心棄上清。

9.加入 250 uL 含溶菌-酶的包涵體純化溶液 A 重懸細(xì)胞。

10.室溫放置 20 分鐘裂解細(xì)菌，其間可以用手輕彈離心管混勻。

11.-20℃冷凍至凝固。注意：一定要凝固到細(xì)菌溶液變成固體為止。

12.室溫水浴解凍。如果裂解充分，細(xì)菌釋放出的 DNA 將使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，說明裂解不充分，需要重復(fù)凍融步，否則完整細(xì)菌將和包涵體一起沉淀，影  響包涵體的純度。最好在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否充分裂解。

13.加入 1 uL Benzonase 溶液(1U/uL)，脫色搖床上搖晃直到裂解液不再粘稠，一般需要 30 分鐘左右，否則還需要延長保溫時間。

14.12,000 rpm 4℃離心 5 分鐘，留存上清作為 SDS-PAGE 的對照樣品一。

15.將沉淀（包涵體）懸浮在 1 mL 的包涵體純化溶液 B 中，室溫放置 5 分鐘。

16.12,000 rpm 4℃離心 10 分鐘，留存上清作為 SDS-PAGE 的對照樣品二。

17.將沉淀（包涵體）懸浮在 1mL 的包涵體純化溶液 B 中，室溫放置 5 分鐘。

18.12,000 rpm 4℃離心 10 分鐘，留存上清作為 SDS-PAGE 的對照樣品三。本產(chǎn)品提供的包涵體純化溶液 B 足夠兩次洗滌（兩次洗滌一般可得到足夠純凈的包涵體）。如果需要更多洗滌，用戶需要單獨購買包涵體洗滌液（溶液 B）。

19.沉淀為純化的包涵體，可以長期放置在冰箱待用或直接用于包涵體溶解。

三：包涵體的溶解：

20.在包涵體沉淀中加入 250 uL 包涵體溶解液，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩室溫放置 1 小時使蛋白質(zhì)充分溶解。脫鹽后可以進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳。注意：包涵體溶解液含6M 鹽酸胍，溶解蛋白能力強(qiáng)于含 8M 尿素的溶解液，但 SDS-PAGE 時不能直接上樣?？蛻艨捎米詡涞哪蛩嘏渲?8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不穩(wěn)定，所以不能長期放置）溶解包涵體，得到的溶解液可以直接用于 SDS-PAGE 或后續(xù)純化。但其溶解能力弱于鹽酸胍。

21.20，000g 4℃離心 20 分鐘，小心收集上清，保留不溶性沉淀（未能溶解的包涵體）。上清脫鹽后進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒有，說明包涵體沒有完-全溶解，需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。包涵體純化過程中引入了溶菌-酶、核酸酶 Benzonase 等外源蛋白質(zhì)，在 SDS-PAGE 分析時可能有額外條帶出現(xiàn)。

22.所得蛋白質(zhì)溶液可以用于復(fù)性等試驗。用戶可本公司購買包涵體復(fù)性套裝。

選擇我們的微量包涵體純化試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護(hù)航！