產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品專門用于乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Acetic Acid-Urea- PAGE，AU-PAGE，乙酸-尿素-PAGE）。

產(chǎn)品特點：

1.一站式，即開即用，用戶不需單獨準備各種成分，十分方便。

2.采用不連續(xù)膠系統(tǒng)，分辨率高，能有效分離只有一個修飾基團不同的組蛋白。

3.使用光激發(fā)劑，故不需要進行長時間的預電泳。

4.適用于分離等電點偏堿性的各種堿性蛋白，如嗜中性防御素、酪-氨酸酶 、魚精-蛋白、組蛋白以及這些堿性蛋白的各種修飾形式（如乙?；?、泛素化等）。

5.電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交等實驗。

6.本產(chǎn)品足夠 30 次 0.1 cm×14 cm×14 cm 大小的 AU-PAGE。

7.乙酸-尿素-PAGE 電泳試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

30次

保存和運輸

常溫運輸和保存，但塑料袋包裝的成分需要低溫運輸，-20℃保存。有效期一年。

自備試劑

去離子水、透析袋（去除樣本中的鹽離子用）。

使用方法：

一：試劑和樣本準備工作 

1.60%丙烯酰胺母液：加 160 mL 自備去離子水到裝有丙烯酰胺干粉的 250 mL 棕色瓶中，終于體積為 250 mL。充分搖晃溶解（不能加熱）。一次沒用完的本溶液可以放 4℃長期保存。

2.2.5%甲叉雙丙烯酰胺母液：加 100 mL 自備去離子水到裝有甲叉雙丙烯酰胺干粉的 120 mL 本色瓶中，搖晃溶解（不能加熱）。沒用完的需 4℃保存。

3.8 M 尿素母液：用本試劑盒提供的尿素干粉和自備的去離子水配制 8 M 的尿素母液。如果配制 10 mL，則將 4.8 g 尿素溶于少量水中，最后定容到 10 mL。沒用完的本溶液需放-20℃保存，避免產(chǎn)生氰酸根離子。

4.待電泳的蛋白樣本必須沒有離子，故最好先用 3500 Da 截留的透析袋在2.5%乙酸溶液中充分透析，然后分裝成 5-50 μg/管，冷凍抽干。也可以用三氯-乙酸沉淀，丙酮洗滌去鹽離子。本試劑盒不提供相關試劑。

二：PAGE 膠的配制（整個過程在常溫操作，不能在低溫操作）

5.下表是配制 0.1 cm×14 cm×14 cm 大小 PAGE 膠所需各成分的用量。由于常見的堿性蛋白組蛋白和魚精-蛋白分子量都比較小，因此需用 4%的濃縮膠濃度和 15%的分離膠濃度。若膠大小變化或者堿性蛋白分子量較大，所配制的膠的體積和濃度需要相應調整。在兩個容器中分別加入下列成分:

6.灌分離膠：按上表配制分離膠，將溶液搖晃混勻，然后用真空泵接上管子抽真空 15 分鐘去除溶液中的氧氣，然后加入 125 ?L 氨水、175 ?L TEMED 和

2.38 mL 光激發(fā)劑，迅速搖勻并灌膠，在分離膠的液面距離膠板頂部 5 cm 的時候，停止灌膠。加入 1 mL 去離子水。由于分離膠比重較大，水將覆蓋分離膠并使得膠面平整。將膠板放在強光下（如看 X 光片的燈箱前）促進光激發(fā)劑活動。室溫聚合 30-60 分鐘。凝固后倒出水，插入梳子。

7.灌濃縮膠：按上表配制分離膠，將溶液搖晃混勻，然后用真空泵接上管子抽真空 15 分鐘去除溶液中的氧氣，加入 35 ?L 氨水、50 ?L TEMED 和 650 ?L 光激發(fā)劑，迅速搖勻并灌膠。將膠板放在明亮處，促進光激發(fā)劑活動。室溫聚合 30-60 分鐘。濃縮膠的高度有 1 cm-2 cm 即可。

三：電泳（整個過程在常溫操作，不能在低溫操作）

8.在等待膠凝固的過程中，配制上樣液：在 1.5 mL 塑料離心管中，加入 7.7 mg 上樣液成分 1，0.9 mL 8 M 尿素母液，50 μL pH 指示劑，50 μL 氨水?；靹蚝蠹吹蒙蠘右?。上樣液只能現(xiàn)配現(xiàn)用，沒有用完的不需要保留。

9.濃縮膠凝固后，拔出梳子，取出膠下面的隔條，將膠板上架到電泳槽上。先在下槽加入 1×AU-PAGE 電泳緩沖液。上槽的電泳緩沖液待上樣后再加。

（注：1×AU-PAGE 電泳緩沖液由本試劑盒提供的 10×AU-PAGE 電泳緩沖液稀釋而來，在 1 倍體積的 10×AU-PAGE 電泳緩沖液中加入 9 倍體積的去離子水，混勻后即可。1×AU-PAGE 電泳緩沖液可以重復使用 3 次）

10.在第 4 步制備的冷凍干燥的蛋白樣本中每管加入上步制備的上樣液 40 μL，室溫溶解 5 分鐘。為避免尿素修飾蛋白，溶解時間不要超過 5 分鐘。如果加入樣本后，溶液不是粉紅色，則表示蛋白樣本中有殘留乙酸使得 pH 過低，蛋白溶解不充分，需要補加氨水調到顏色變成粉紅色，恢復堿性。

11.上樣前每管補加 2.5 μL 乙酸進行酸化，再加 2 μL AU-PAGE 電泳示蹤劑，補水到總體積為 50 μL（補水多少取決于第 10 步加入了多少氨水調 pH）。

12.將 50 μL（含 5-50 μg 總蛋白質）全部上樣，多余的加樣孔中要加入空白樣本（40 μL 上樣液+2.5 μL 乙酸+2 μL AU-PAGE 電泳示蹤劑+5.5 μL 去離子水）以平衡電泳時各加樣孔的鹽離子濃度。

13.小心在上槽加滿新鮮配制的 AU-PAGE 電泳液。加入了 AU-PAGE 電泳液后的凝膠必須立即使用，不得放置。

14.接上電源線。注意 AU-PAGE 的電泳方法跟 SDS-PAGE 相反，故正極需要接到上槽，負極需要接到下槽。堿性蛋白在電泳體系中帶正電，向負極移動。

15.固定電壓到 300 V 電泳，如果是小的膠，可以固定電壓到 250 V 電泳。在電泳過程中電流將逐漸降低。整個過程在常溫操作，不能在低溫操作。

16.當電泳示蹤劑快到膠的邊緣時停止電泳。

17.對 AU-PAGE 膠進行考染（本試劑盒不含考染相關試劑）：將 5 g 考馬斯亮藍R-250 溶解在 500 mL 脫色液（20%甲醛，7%乙酸）中，如果有不溶解的顆?？梢赃^濾去除，放入 AU-PAGE 膠后搖晃 1 小時。然后在脫色液

（20%甲醛，7%乙酸）中脫色直到調條帶顯現(xiàn)。注意：常見的堿性蛋白Histone 和魚精-蛋白分子量都比較小，故不能使用固定步驟。

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