產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

葉綠體是重要的，負(fù)責(zé)植物光合作用的細(xì)胞器，很多重要的特性(如雄性不育) 也跟葉綠體相關(guān)，所以葉綠體是研究植物生理和母系遺傳的重要材料。對(duì)植物葉綠體進(jìn)行生化，遺傳和分子生物學(xué)研究都需要進(jìn)行葉綠體純化。本產(chǎn)品就是基于密度梯度離心的，專(zhuān)門(mén)用于從葉片中純化完整葉綠體的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即用型試劑盒，用戶(hù)不需要單獨(dú)配制各種溶液。

2.提供 AB 兩種選擇，A 型用于葉綠體粗提，所得葉綠體含少量其他細(xì)胞器污染，可用于后續(xù)的 SDS-PAGE，Western，ELSIA 和蛋白組分析。B 型用于葉綠體精提，所得葉綠體完整，可用于后續(xù)的光合作用，電子鏈和磷酸化， 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，體外葉綠體蛋白合成，蛋白定位等研究。還可用于的葉綠體膜， 基質(zhì)，類(lèi)囊體，葉綠體 DNA 和葉綠體 RNA 純化。

3.已經(jīng)成功用于菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等植物，還可用于更多植物（可能需要優(yōu)化條件）。

4.本產(chǎn)品足夠 15 次提取，每次可處理 30g 葉片，能得到 5 mg 左右葉綠體。

5.植物葉綠體純化試劑盒只可用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成分規(guī)格包裝

植物葉綠體純化勻漿液成分一250 mL×2250 mL 本色瓶

植物葉綠體純化勻漿液成分二（干粉）3 g10mL 本色瓶

帶柄尼龍濾膜1 個(gè)塑料袋

Percoll60 mL60 mL 本色瓶

使用手冊(cè)1 份無(wú)

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存，成分二（干粉）低溫保存，有效期一年。

自備試劑

去離子水。

使用方法：

注意：葉綠體對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。離心時(shí)一定要在 4℃進(jìn)行，離心力以 g 而不是 rpm 計(jì)算。如果需要研究葉綠體的功能，提取過(guò)程還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。

1.實(shí)驗(yàn)前 1-2 天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時(shí)這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實(shí)驗(yàn)前需先用自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時(shí)需要保持葉片濕潤(rùn)，即使如此，葉片的放置時(shí)間也不能超過(guò)一天。

2.新鮮（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天）制備植物葉綠體純化勻漿液：將自備的去離子水與植物葉

綠體純化勻漿液成分一按 4：1 的比例混合，然后在混合液中加入植物葉綠體純化勻漿液成分二干粉到終濃度 0.1%（每 100 mL 中加入 0.1g 干粉），搖晃溶解后所得溶液即為植物葉綠體純化勻漿液，冰上預(yù)冷待用。一次實(shí)驗(yàn)（從  30 g 葉片提取葉綠體）所需要的植物葉綠體純化勻漿液體積跟材料不同而不同。植物葉綠體純化勻漿液不能長(zhǎng)期保存，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

3.新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈并將葉片剪成 1-3 cm2 大小的碎片并浸泡在適量的預(yù)冷的植物葉綠體純化勻漿液中（每克葉片加 4 mL 植物葉綠體純化勻漿液，但對(duì)煙草和大豆，每克葉片需要加 6 mL 植物葉綠體純化勻漿液）。

4.將浸泡了葉片的植物葉綠體純化勻漿液轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)）中，低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿 10 秒。注意：除 Waring 勻漿機(jī)外，還可以選擇 Dounce 玻璃勻漿器，Polytron 勻漿機(jī)和研磨（加玻璃珠）等裂解細(xì)胞的方法，但這些方法的單次處理量都比較小，需要將樣品分成很多小份單獨(dú)勻漿，然后再匯集。

5.用帶柄尼龍濾膜過(guò)濾勻漿液，可先將濾液收集到預(yù)冷的 200 mL 量筒中，再等分到 4 個(gè)預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個(gè)管中的濾液不要超過(guò) 35 mL）。帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。

6.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 200 g 離心 3 分鐘（對(duì)菠菜，白菜和萵筍材料）或400 g 離心 1 分鐘（對(duì)甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細(xì)胞或細(xì)胞核。

7.將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的、預(yù)冷的 50 mL 塑料離心管中。

8.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體， 呈淺綠色。

9.在沉淀中加入 1.5 mL 預(yù)冷的植物葉綠體純化勻漿液，手彈離心管底部使葉綠體重懸。注意：重懸時(shí)最好避免溶液起泡，也不要用槍頭吹打，否則葉綠體容易破裂。沉淀下有白色淀粉屬于正?，F(xiàn)象，但重懸葉綠體時(shí)避免將白色淀粉重懸。

10.將 4 管葉綠體重懸液匯集（共約 6 mL）。此溶液為葉綠體粗提液，可直接用于后續(xù)的 SDS-PAGE，Western，ELSIA 和蛋白組分析。

11.如果需要以之為材料精提葉綠體，就需要將破裂的葉綠體和完整的葉綠體分開(kāi)，根據(jù)植物的不同，可選用下述兩種密度梯度離心法之一進(jìn)行分離。

12.單密度梯度分離法（適合菠菜，白菜和萵筍等材料）：

a)在 50 mL 塑料離心管中先加入 6 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 4 mL Percoll，充分混合均勻。

b)在其液面上小心鋪上第 10 步匯集得到的約 6 mL 葉綠體重懸液。

c)在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1700 g 離心 6 分鐘，最上層的綠色帶含破碎的葉綠體，線粒體和核糖體等，管底的綠色沉淀為完整的葉綠體。

d)小心將上清倒出后，在葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液成分一，手指輕彈管底使之重懸。

e)將葉綠體重懸液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管中并避光保存?？稍谙嗖铒@微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。

13.雙密度梯度分離法（適合煙草，甜菜和大豆等材料）：

a)在 14 mL 塑料離心管中先加入 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 2 mL Percoll，充分混合均勻，得密度梯度重液。

b)在另一試管中將 3 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 2 mL Percoll 充分混合均勻，得密度梯度輕液。

c)將密度梯度輕液小心鋪在密度梯度重液之上，然后將第 10 步匯集得到的葉綠體重懸液中的 4 mL(還剩下 2 mL)小心鋪在密度梯度輕液之上。

d)在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 3200 g 離心 15 分鐘，最上層綠色帶含破碎的葉綠體、線粒體和核糖體等，重液和輕液間的綠色帶為完整葉綠體。

e)用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶（葉綠體）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入三倍體積的預(yù)冷的植物葉綠體純化勻漿液成分一（非植物葉綠體純化勻漿液），輕柔混勻。

f)在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1700 g 離心 1 分鐘，小心將上清倒出后，在綠色的葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液成分一

（非植物葉綠體純化勻漿液），手指輕彈管底使之葉綠體重懸。

g)將葉綠體重懸液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 離心管中并避光保存，也可在相差顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。

14.所得精提葉綠體可用于后續(xù)的光合作用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，體外葉綠體蛋白合成，蛋白定位等研究。還可用于的葉綠體膜，基質(zhì)，類(lèi)囊體，葉綠體 DNA、葉綠體 RNA 和總蛋白純化。

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