2-8℃

1.離心管中的過(guò)濾膜一旦潤(rùn)濕后應(yīng)避免變干。如果在預(yù)清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用。
2.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！

一年

植物

1.使用方便，無(wú)需超速離心，省時(shí)省力；
2.純度高，富集量大，應(yīng)用范圍廣；
3.獲取的Exosome結(jié)構(gòu)和功能完整；
4.穩(wěn)定性好，便于運(yùn)輸，便于保存。

根據(jù)需要使用

1.離心機(jī) 2.移液器 3.冰箱 4.冰盒

1.PBS緩沖液 2.純水

1.離心管2.吸頭3.一次性手套

1.不同樣本的外泌體數(shù)量差異極大，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇樣品的量，根據(jù)下游應(yīng)用和參考文獻(xiàn)確定。條件允許的情況下采用盡可能多的樣本。
2.已經(jīng)分離好的外泌體樣本如果需要進(jìn)行電鏡觀察，只能冰上或4℃保存，存放時(shí)間不超過(guò)兩天，注意不可冷凍保存，否則可能會(huì)影響電鏡觀察效果。

清洗外泌體純化離心管C：
1.用緩沖液或純水進(jìn)行預(yù)清洗。
2.離心管中的過(guò)濾膜一旦潤(rùn)濕后應(yīng)避免變干。如果在預(yù)清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用前移除并稍微離心甩干。

樣品處理：
1.收集500 mg-1 g新鮮的待提取植物樣品，根據(jù)不同樣品進(jìn)行剝皮、清洗等處理，置2-8℃保存。
2.在樣品中加入1-2 ml試劑A，然后用勻漿機(jī)/勻漿器充分勻漿。
3.將勻漿液1000×g離心15分鐘。棄沉淀，收集上清。
4.小心將上清移入另一干凈離心管中。
5.將樣品在4℃條件下，3000×g離心30分鐘。棄沉淀，收集上清。
6.小心將上清移入另一干凈離心管中。
7.將樣品在4℃條件下，12000×g離心60分鐘。棄沉淀，收集上清。
8.小心將上清移入另一干凈離心管中。即得到待提取植物勻漿液（0）。


外泌體粗提：
1.將待提取植物勻漿液（0）上清吸入離心管D中，套上液體收集管，在4℃，10000×g條件下離心5-10分鐘。

2.將液體收集管中的液體吸入另一干凈離心管。在4℃，16000×g條件下離心20分鐘。棄沉淀，收集上清。即為1-2 ml外泌體粗提液（I）。
3.將外泌體粗提液（I）吸入另一干凈離心管。在4℃，16000×g條件下離心20分鐘。棄沉淀，收集上清。即為1-2 ml外泌體粗提液（II）。然后進(jìn)行下列外泌體純化步驟操作。

外泌體純化：
1.將外泌體純化離心管C（大）內(nèi)管插入所提供的一個(gè)配套離心管中。
2.向內(nèi)管中加入2 ml的外泌體粗提液（II）樣本，并蓋上蓋子。
3.將蓋好蓋子的外泌體純化離心管放入離心轉(zhuǎn)子中，用一個(gè)類似的離心管平衡。
4.以4000-10000×g離心約10-30分鐘。離心至大約剩余100 μl液體。
5.在50-100 μl殘余液體中加入1 ml外泌體提取液B。
6.以4000-10000×g離心約10-30分鐘。離心至大約剩余100 μl液體。
7.離心結(jié)束后將整個(gè)離心管從離心機(jī)中取出，取出內(nèi)管。
8.為了回收純化后的外泌體，用200 μl移液器插入純化管的底部，吸出純化后的約100 μl純化外泌體懸液，即得到外泌體樣品純品。。
9.用純水或緩沖液洗滌離心管C的內(nèi)管和收集管，繼續(xù)純化下一個(gè)樣品。

外泌體純化離心管C（大）清洗和保存：
1.使用后用水沖洗干凈；
2.內(nèi)管加入超純水4 ml，4000×g離心5分鐘；
3.吸凈內(nèi)管中的水，加入4 ml 0.1M NaOH，4000×g離心20分鐘；
4.用0.1 M NaOH 浸泡24小時(shí)；
5.用水沖洗干凈；
6.用無(wú)菌水浸泡2-8℃保存。
7.外管用自來(lái)水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。

1.準(zhǔn)備做植物外泌體研究，初始樣品量需要準(zhǔn)備多少？
不同樣本外泌體含量差異較大，根據(jù)文獻(xiàn)選擇起始樣本量。有條件的情況下盡可能使用多一點(diǎn)樣本量。

2.如何鑒定提取的外泌體？
通常使用透射電鏡檢測(cè)（形態(tài)）、粒徑檢測(cè)（大?。?、外泌體標(biāo)志蛋白Western blot檢測(cè)等方法鑒定提取的外泌體。

3.進(jìn)行外泌體WB鑒定時(shí)有什么內(nèi)參蛋白可供選擇？
沒(méi)有，該檢測(cè)屬于定性檢測(cè)。

4.蛋白濃度低？
很多樣本外泌體量不夠下游應(yīng)用，在條件允許的情況請(qǐng)盡可能加大植物樣本的上樣量。
處理部分外泌體樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解，導(dǎo)致蛋白濃度低。請(qǐng)選擇高質(zhì)量的蛋白裂解液或蛋白提取試劑盒。

5.外泌體純化管內(nèi)管膜會(huì)因?yàn)殡x心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而變干么？
不會(huì)，因?yàn)閮?nèi)管有死體積，總會(huì)有溶液殘留在內(nèi)管中。死體積大約20 μl。

6.可以重復(fù)使用過(guò)濾管么？
可以重復(fù)使用。如果使用、清洗、保存得當(dāng)，可以反復(fù)使用多次。但是超過(guò)8次重復(fù)使用后過(guò)濾膜有破損風(fēng)險(xiǎn)，注意使用過(guò)程中盡量避免尖銳物品戳到膜。離心力不要過(guò)大。

1.Ruiyu Liu, et al.
iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstruction
Experimental Cell Research 2020

2.Feng Tian, et al.
miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 Expression
Journal of Diabetes Research 2020