PRM分析優(yōu)化指南:如何在Orbitra
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- 公司名稱 北京百泰派克生物科技有限公司
- 品牌 百泰派克
- 型號
- 產(chǎn)地 中國
- 廠商性質(zhì) 其他
- 更新時間 2025/7/8 16:12:20
- 訪問次數(shù) 65
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業(yè)務(wù)范圍主要圍繞蛋白和小分子代謝物檢測兩大板塊,從事蛋白質(zhì)和小分子代謝物的理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)解析等相關(guān)技術(shù)服務(wù),為客戶提供高性價比、高效率的技術(shù)服務(wù)。
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PRM分析優(yōu)化指南:如何在Orbitrap平臺上實現(xiàn)精確定量?檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹
在dànbáizhì組學(xué)研究中,PRM(Parallel Reaction Monitoring)技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高而被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物驗證、機(jī)制研究與生物藥開發(fā)等領(lǐng)域。尤其是在高分辨率質(zhì)譜平臺Orbitrap上的應(yīng)用,使得PRM的定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性達(dá)到新的高度。然而,實現(xiàn)真正的jīngquè定量并非僅依賴于儀器性能,更需在樣本準(zhǔn)備、方法開發(fā)、參數(shù)設(shè)定、數(shù)據(jù)采集與分析等每一環(huán)節(jié)精益求精。本文將系統(tǒng)解析如何在Orbitrap平臺上優(yōu)化PRM分析流程,幫助研究人員提升數(shù)據(jù)質(zhì)量與研究效率。
一、樣本制備:jīngzhǔn定量的前提保障
1、樣本類型與保存策略
PRM分析對樣本質(zhì)量極為敏感,推薦使用以下類型:
(1)組織樣本: 腫瘤、心腦組織等需快速冷凍,-80℃儲存;
(2)細(xì)胞樣本: 采用yíméi消化或刮板收集,加入裂解液立即處理;
(3)體液樣本: 如血清、血漿、腦脊液等,采集后應(yīng)快速離心除雜、分裝冷凍。
避免多次凍融是確保蛋白完整性和定量一致性的關(guān)鍵。
2、蛋白提取與消化標(biāo)準(zhǔn)化
(1)裂解液選擇: RIPA適用于多種細(xì)胞結(jié)構(gòu),8M尿素用于難溶蛋白提取。
(2)還原與烷基化: 使用DTT(或TCEP)還原二硫鍵,IAA封閉游離巰基,保障酶解一致性。
(3)酶解: 常規(guī)使用Trypsin按1:50比例(酶:底物)過夜酶解,37℃保溫;
(4)純化: 采用C18柱純化脫鹽去雜質(zhì),提高肽段質(zhì)量與MS兼容性。
確保前處理一致性是實現(xiàn)jīngquè定量的基礎(chǔ),建議引入QC樣本監(jiān)控操作波動。
二、靶標(biāo)肽段篩選與穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)設(shè)計
1、肽段篩選邏輯
(1)來源多樣: 可基于DDA結(jié)果、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)或公共數(shù)據(jù)庫(如PeptideAtlas);
(2)篩選標(biāo)準(zhǔn): 不含修飾位點、跨膜區(qū)域與共享肽段,保留時間穩(wěn)定、響應(yīng)強(qiáng);
(3)目標(biāo)數(shù)量: 單項目推薦每個蛋白選2-3個高質(zhì)量肽段用于驗證。
2、內(nèi)標(biāo)肽(SIS)設(shè)計與應(yīng)用
(1)合成方式: 通常使用13C/15N標(biāo)記氨基酸標(biāo)記目標(biāo)肽段;
(2)加入時機(jī): 建議于酶解后加入,避免因樣本處理損耗帶來的誤差;
(3)定量模式: 可用于相對定量(歸一化)或構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)juéduì定量。
內(nèi)標(biāo)的存在極大提升了PRM的重復(fù)性與跨批次一致性,是jīngquè定量bùkěhuòquē的關(guān)鍵。
三、方法開發(fā)與Orbitrap參數(shù)優(yōu)化指南
1、質(zhì)譜方法設(shè)置
(1)前體離子選擇: 根據(jù)響應(yīng)強(qiáng)度、碎片譜圖選擇主m/z值;
(2)碎片離子設(shè)定: 選取多個強(qiáng)度高、無干擾的碎片離子,確保定量準(zhǔn)確;
(3)RT窗口安排: 使用RT scheduling功能jīngzhǔn采集,提高采集效率與特異性;
2、Orbitrap平臺核心參數(shù)
(1)分辨率: 建議設(shè)置在30,000–60,000(MS2),高分辨提高背景分離能力;
(2)注入時間(IT)與AGC: 通常設(shè)置IT為80–150ms,AGC target為1e5–2e5,根據(jù)靶點強(qiáng)度優(yōu)化;
(3)Isolation Window: 設(shè)定為1.2–2.0 Th,兼顧靈敏度與特異性;
(4)動態(tài)排除: 開啟有助于避免干擾重復(fù)掃描,提高采集效率。
四、數(shù)據(jù)采集與Skyline分析流程詳解
1、原始數(shù)據(jù)采集要點
(1)QC策略: 每10個樣本注入一次QC樣本,監(jiān)控儀器狀態(tài)與樣本一致性;
(2)監(jiān)控指標(biāo): 總離子流(TIC)、保留時間穩(wěn)定性、SIS峰響應(yīng)、背景噪聲水平等;
2、Skyline分析流程全解析
(1)導(dǎo)入raw文件與PRM方法配置: 設(shè)置靶標(biāo)序列、m/z值、RT窗口;
(2)提取XIC與峰識別: 自動調(diào)用碎片離子色譜圖,選擇峰面積zuì大區(qū)域;
(3)RT校準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)比值計算: 校正保留時間偏移,計算SIS/Target比值;
(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合(如適用): 構(gòu)建線性擬合曲線,計算LOD/LOQ;
(5)批量歸一化與可視化: 使用熱圖、火山圖、PCA呈現(xiàn)結(jié)果;
(6)統(tǒng)計分析: 進(jìn)行t檢驗、ANOVA、多重假設(shè)校正等。
Skyline的使用貫穿PRM數(shù)據(jù)處理始終,是提升定量效率與質(zhì)量的核心工具。
五、優(yōu)化建議與常見問題解答(FAQ)
Q1:低豐度蛋白信號弱,如何優(yōu)化?
優(yōu)化酶解條件或使用免疫富集策略;延長質(zhì)譜注入時間,提高靶肽捕獲能力;優(yōu)選響應(yīng)更強(qiáng)、背景干擾更低的替代表肽段。
Q2:靶點過多采集不全怎么辦?
啟用時間窗口調(diào)度(RT scheduling),避免同時間掃描過多肽段;按功能或表達(dá)量分批采集,或采用多輪運行策略。
Q3:結(jié)果波動大,可能的原因?
內(nèi)標(biāo)響應(yīng)不穩(wěn):建議更換或重新合成SIS;酶解效率波動:增加QC樣本,監(jiān)控酶解一致性;儀器狀態(tài)不穩(wěn):定期維護(hù)并做好每日性能驗證。
百泰派克生物科技憑借豐富的靶標(biāo)經(jīng)驗與強(qiáng)大的Orbitrap Exploris平臺,建立了標(biāo)準(zhǔn)化、高通量的PRM分析服務(wù)體系,服務(wù)涵蓋:
靶標(biāo)選擇與SIS合成建議
方法開發(fā)與Skyline模板配置
多樣本、跨批次標(biāo)準(zhǔn)化分析
可視化報告(含火山圖、熱圖、PCA)+ RAW原始圖譜交付
我們支持癌癥、代謝病、炎癥、自免等多領(lǐng)域研究,從科研探索到臨床轉(zhuǎn)化,提供zhídexìnlài的技術(shù)支撐。PRM不僅僅是一種定量手段,它是連接“發(fā)現(xiàn)”與“驗證”的核心橋梁。要在Orbitrap平臺上實現(xiàn)真正可靠的dànbáizhì定量結(jié)果,必須從樣本質(zhì)量、靶標(biāo)選擇、內(nèi)標(biāo)引入、參數(shù)設(shè)定到數(shù)據(jù)處理全過程優(yōu)化。百泰派克生物科技通過多年實踐與技術(shù)積累,為科研人員提供高覆蓋率、高重復(fù)性、高解讀力的PRM解決方案。讓每一次分析,不止于結(jié)果,更指向科學(xué)的深度洞察。
百泰派克生物科技特色項目
一、蛋白測序
百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進(jìn)行分析,提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務(wù),包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析,Nduāncèxù,Cduāncèxù和全序列分析,以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對于未知理論序列的dànbáizhì,提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務(wù),對蛋白序列進(jìn)行分析。
※服務(wù)優(yōu)勢:
1.采用目前世界上*的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;
2.可實現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;
3.可測定蛋白N端多達(dá) 70個氨基酸序列;
4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;
5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug,即可完成檢測;
6.測序不受N端封閉,PEC和和糖基化等N端修飾的影響。
二、dànbáizhì組學(xué)
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結(jié)合Nano-LC,提供定量dànbáizhì組學(xué)、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外,百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù),助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。
※服務(wù)優(yōu)勢:
1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析,發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;
2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法,適用于分析組織、細(xì)胞、血液等多種樣品;
3.質(zhì)譜分析靈敏度高,實驗結(jié)果重復(fù)度高;
4.可檢測較低豐度蛋白,線性范圍廣;
5.zhuānyè生物信息學(xué)分析,分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。
三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析
百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析,采用金屬元素標(biāo)記物(通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體)標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子,然后用流式細(xì)胞原理分離單個細(xì)胞,再用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜,zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子表達(dá)量。
※服務(wù)優(yōu)勢:
1.技術(shù)*,*技術(shù)空白
采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù),避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細(xì)胞層面上對多種指標(biāo)同時進(jìn)行表征,百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標(biāo)蛋白。
2.分析數(shù)量大,成本較低
單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制,所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右,而流式質(zhì)譜技術(shù)一次(單樣本)就可分析至少10^5的細(xì)胞,實現(xiàn)了數(shù)量級的提高,且成本不高于單細(xì)胞RNAseq。
3.應(yīng)用前景大
①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化,在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景;
②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外,質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾;
③可檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。
四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)
百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析,可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究,旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案,深入挖掘未知的靶標(biāo)。
五、生物藥物表征
百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù),MALDI TOF,高效色譜分離技術(shù),提供一系列完善的生物藥物分析方案,從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)分析,到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù),幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。
百泰派克生物科技七大檢測平臺
百泰派克生物科技-生物制品表征,生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商
北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務(wù)。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則,通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證,建立了完備的質(zhì)量體系,數(shù)據(jù)冷熱/異地備份,設(shè)備定期計量/期間核查,軟件審計追蹤,為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù),支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行。
1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系,zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測分析服務(wù);
2.獲國家CNAS實驗室認(rèn)可,為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù);
3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等;
4.七大質(zhì)量控制檢測平臺,滿足您一站式服務(wù)需求;
5.服務(wù)3000+企業(yè),10000+客戶的選擇;
6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!