PRM分析優(yōu)化指南：如何在Orbitrap平臺上實現(xiàn)精確定量？檢測技術服務詳情介紹

在dànbáizhì組學研究中，PRM（Parallel Reaction Monitoring）技術因其特異性強、靈敏度高而被廣泛應用于生物標志物驗證、機制研究與生物藥開發(fā)等領域。尤其是在高分辨率質(zhì)譜平臺Orbitrap上的應用，使得PRM的定量準確性和重復性達到新的高度。然而，實現(xiàn)真正的jīngquè定量并非僅依賴于儀器性能，更需在樣本準備、方法開發(fā)、參數(shù)設定、數(shù)據(jù)采集與分析等每一環(huán)節(jié)精益求精。本文將系統(tǒng)解析如何在Orbitrap平臺上優(yōu)化PRM分析流程，幫助研究人員提升數(shù)據(jù)質(zhì)量與研究效率。

一、樣本制備：jīngzhǔn定量的前提保障

1、樣本類型與保存策略

PRM分析對樣本質(zhì)量極為敏感，推薦使用以下類型：

（1）組織樣本： 腫瘤、心腦組織等需快速冷凍，-80℃儲存；

（2）細胞樣本： 采用yíméi消化或刮板收集，加入裂解液立即處理；

（3）體液樣本： 如血清、血漿、腦脊液等，采集后應快速離心除雜、分裝冷凍。

避免多次凍融是確保蛋白完整性和定量一致性的關鍵。

2、蛋白提取與消化標準化

（1）裂解液選擇： RIPA適用于多種細胞結構，8M尿素用于難溶蛋白提取。

（2）還原與烷基化： 使用DTT（或TCEP）還原二硫鍵，IAA封閉游離巰基，保障酶解一致性。

（3）酶解： 常規(guī)使用Trypsin按1:50比例（酶:底物）過夜酶解，37℃保溫；

（4）純化： 采用C18柱純化脫鹽去雜質(zhì)，提高肽段質(zhì)量與MS兼容性。

確保前處理一致性是實現(xiàn)jīngquè定量的基礎，建議引入QC樣本監(jiān)控操作波動。

二、靶標肽段篩選與穩(wěn)定同位素內(nèi)標設計

1、肽段篩選邏輯

（1）來源多樣： 可基于DDA結果、文獻數(shù)據(jù)或公共數(shù)據(jù)庫（如PeptideAtlas）；

（2）篩選標準： 不含修飾位點、跨膜區(qū)域與共享肽段，保留時間穩(wěn)定、響應強；

（3）目標數(shù)量： 單項目推薦每個蛋白選2-3個高質(zhì)量肽段用于驗證。

2、內(nèi)標肽（SIS）設計與應用

（1）合成方式： 通常使用13C/15N標記氨基酸標記目標肽段；

（2）加入時機： 建議于酶解后加入，避免因樣本處理損耗帶來的誤差；

（3）定量模式： 可用于相對定量（歸一化）或構建標準曲線實現(xiàn)juéduì定量。

內(nèi)標的存在極大提升了PRM的重復性與跨批次一致性，是jīngquè定量bùkěhuòquē的關鍵。

三、方法開發(fā)與Orbitrap參數(shù)優(yōu)化指南

1、質(zhì)譜方法設置

（1）前體離子選擇： 根據(jù)響應強度、碎片譜圖選擇主m/z值；

（2）碎片離子設定： 選取多個強度高、無干擾的碎片離子，確保定量準確；

（3）RT窗口安排： 使用RT scheduling功能jīngzhǔn采集，提高采集效率與特異性；

2、Orbitrap平臺核心參數(shù)

（1）分辨率： 建議設置在30,000–60,000（MS2），高分辨提高背景分離能力；

（2）注入時間（IT）與AGC： 通常設置IT為80–150ms，AGC target為1e5–2e5，根據(jù)靶點強度優(yōu)化；

（3）Isolation Window： 設定為1.2–2.0 Th，兼顧靈敏度與特異性；

（4）動態(tài)排除： 開啟有助于避免干擾重復掃描，提高采集效率。

四、數(shù)據(jù)采集與Skyline分析流程詳解

1、原始數(shù)據(jù)采集要點

（1）QC策略： 每10個樣本注入一次QC樣本，監(jiān)控儀器狀態(tài)與樣本一致性；

（2）監(jiān)控指標： 總離子流（TIC）、保留時間穩(wěn)定性、SIS峰響應、背景噪聲水平等；

2、Skyline分析流程全解析

（1）導入raw文件與PRM方法配置： 設置靶標序列、m/z值、RT窗口；

（2）提取XIC與峰識別： 自動調(diào)用碎片離子色譜圖，選擇峰面積zuì大區(qū)域；

（3）RT校準與內(nèi)標比值計算： 校正保留時間偏移，計算SIS/Target比值；

（4）標準曲線擬合（如適用）： 構建線性擬合曲線，計算LOD/LOQ；

（5）批量歸一化與可視化： 使用熱圖、火山圖、PCA呈現(xiàn)結果；

（6）統(tǒng)計分析： 進行t檢驗、ANOVA、多重假設校正等。

Skyline的使用貫穿PRM數(shù)據(jù)處理始終，是提升定量效率與質(zhì)量的核心工具。

五、優(yōu)化建議與常見問題解答（FAQ）

Q1：低豐度蛋白信號弱，如何優(yōu)化？

優(yōu)化酶解條件或使用免疫富集策略；延長質(zhì)譜注入時間，提高靶肽捕獲能力；優(yōu)選響應更強、背景干擾更低的替代表肽段。

Q2：靶點過多采集不全怎么辦？

啟用時間窗口調(diào)度（RT scheduling），避免同時間掃描過多肽段；按功能或表達量分批采集，或采用多輪運行策略。

Q3：結果波動大，可能的原因？

內(nèi)標響應不穩(wěn)：建議更換或重新合成SIS；酶解效率波動：增加QC樣本，監(jiān)控酶解一致性；儀器狀態(tài)不穩(wěn)：定期維護并做好每日性能驗證。

百泰派克生物科技憑借豐富的靶標經(jīng)驗與強大的Orbitrap Exploris平臺，建立了標準化、高通量的PRM分析服務體系，服務涵蓋：

• 靶標選擇與SIS合成建議

• 方法開發(fā)與Skyline模板配置

• 多樣本、跨批次標準化分析

• 可視化報告（含火山圖、熱圖、PCA）+ RAW原始圖譜交付

我們支持癌癥、代謝病、炎癥、自免等多領域研究，從科研探索到臨床轉化，提供zhídexìnlài的技術支撐。PRM不僅僅是一種定量手段，它是連接“發(fā)現(xiàn)”與“驗證”的核心橋梁。要在Orbitrap平臺上實現(xiàn)真正可靠的dànbáizhì定量結果，必須從樣本質(zhì)量、靶標選擇、內(nèi)標引入、參數(shù)設定到數(shù)據(jù)處理全過程優(yōu)化。百泰派克生物科技通過多年實踐與技術積累，為科研人員提供高覆蓋率、高重復性、高解讀力的PRM解決方案。讓每一次分析，不止于結果，更指向科學的深度洞察。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務。對于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優(yōu)勢：

1.采用目前世界上*的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學、靶向dànbáizhì組學、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種dànbáizhì組學分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫(yī)學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學分析，分析更系統(tǒng)準確。

三、單細胞質(zhì)譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進行單細胞質(zhì)譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉換為細胞表面和內(nèi)部的信號分子表達量。

※服務優(yōu)勢：

1.技術*，*技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題?？稍趩渭毎麑用嫔蠈Χ喾N指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右，而流式質(zhì)譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現(xiàn)了數(shù)量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質(zhì)譜結果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從zuì小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學優(yōu)質(zhì)服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務；

3.業(yè)務范圍覆蓋dànbáizhì組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求；

5.服務3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務!

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