Human Intestine Organoid Kit

人小腸類器官培養(yǎng)基套裝

1、 產(chǎn)品描述

?；锶诵∧c類器官培養(yǎng)試劑盒（Human Intestine Organoid Kit）是一款用于建立和維持人腸道成體干細(xì)胞來源的小腸類器官培養(yǎng)基套裝，該試劑盒提供了完整的從小腸隱窩分離、隱窩回收、隱窩活性分析及培養(yǎng)的全套試劑?？奢^大程度維持小腸隱窩的活性，并提升小腸類器官的形成率，所培養(yǎng)的人小腸類器官主要由小腸干細(xì)胞、快速擴(kuò)增細(xì)胞、腸吸收細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，人小腸類器官能部分重現(xiàn)人腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機(jī)制研究的理想體外模型。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 人小腸類器官培養(yǎng)基的制備

在無菌超凈工作臺(tái)中配制人小腸類器官培養(yǎng)基。以配制10mL人小腸類器官培養(yǎng)基為例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1、   冰上解凍人小腸類器官培養(yǎng)因子B(50x)，人小腸類器官培養(yǎng)因子C(250x)，人小腸類器官培養(yǎng)因子D(250x)。

注意：解凍后，建議將人小腸類器官培養(yǎng)因子B(50x)、人小腸類器官培養(yǎng)因子C(250x)。分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺(tái)中根據(jù)日常需求量進(jìn)行分裝，推薦分裝成10mL/管。

3、   分裝后的培養(yǎng)基請(qǐng)密封后儲(chǔ)存于-20℃，使用時(shí)取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

注意：配制后的人小腸類器官培養(yǎng)基可在2-8°C儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。此外，人小腸類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

5、 人小腸類器官的建立與傳代培養(yǎng)

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

a)     原代人小腸類器官的建立

1、   取樣：使用離心管將原代人小腸組織收集在冰冷的原代組織保護(hù)液中，將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2、   清洗：將組織樣本轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)冷DPBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，腸腔面朝上，一只手使用夾住腸組織一端，另一只手使用片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗2次。將清洗后的小腸碎至2mm寬，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用DPBS清洗2遍。

3、   消化：將清洗好的腸段轉(zhuǎn)移至含有5mM/L EDTA的預(yù)冷DPBS中消化，置于4℃或碎冰中孵育20~30min，消化20min左右可用移液器輕柔吹打腸段，取上清顯微鏡下觀察，待上清出現(xiàn)完整隱窩即可終止消化，若無隱窩可適當(dāng)延長消化時(shí)間。

4、   清洗：消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)2次以去除EDTA。

5、   重懸：用5mL移液管在預(yù)冷的0.1%BSA的DPBS的培養(yǎng)皿或50mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以產(chǎn)生機(jī)械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對(duì)吹打后的組織懸液進(jìn)行70μm濾網(wǎng)過濾。

6、   收集：收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，300g離心力4℃離心3min。

7、   計(jì)數(shù)：棄上清，使用1mL0.1%BSA的DPBS重懸組織沉淀，取20μL懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300g離心力4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

8、   用適量的基質(zhì)膠重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10μL基質(zhì)膠懸液包含70至100個(gè)隱窩，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過30s以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

9、   將基質(zhì)膠和組織細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正，每孔30μL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。。10.將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固。

10、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的人小腸類器官培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

11、 將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

12、 每2~3天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)避免破壞基質(zhì)膠。密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，人小腸類器官應(yīng)在5至7天內(nèi)建成。

b)      人小腸類器官的傳代培養(yǎng)

1、   待人小腸類器官培養(yǎng)到直徑為200~500μm大小時(shí)（或變黑不再增大時(shí)），即可進(jìn)行人小腸類器官的傳代（每代約5天左右）。用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將小腸類器官和培養(yǎng)基懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過潤洗液潤洗的1.5mLEP管中。

2、   用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力吹打重懸類器官懸浮液，多次吹打（5~10次）使小腸類器官與基質(zhì)膠分離吹，300g離心3min。

3、   棄上清，加入1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基再次吹打類器官5~10次，取少量懸液鏡檢觀察類器官狀態(tài)：

1)      若類器官已分散成碎片則可選擇機(jī)械吹打分散類器官后直接300g離心3min，離心后用PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次。

2)      若類器官比較完整可300g離心3min后，棄上清，加入5倍于基質(zhì)膠和人小腸類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化2min。加入5倍于消化液體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化。離心后用PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次。

4、   用適量的基質(zhì)膠重懸清洗后的類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過30s以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

5、   將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30μL左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

6、   將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

7、   配制人小腸類器官培養(yǎng)基。

8、   待基質(zhì)膠凝固后，沿孔壁加入提前預(yù)熱的人小腸類器官培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL。

9、   將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，密切觀察人小腸類器官的生長狀態(tài)，每3天于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個(gè)視野中的人小腸類器官的形態(tài)和分布。

V2.0版

更新時(shí)間：2025/6/17