如何使用SEC-HPLC進(jìn)行蛋白質(zhì)純度與均一性分析？檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹

在生物制藥及生命科學(xué)研究中，dànbáizhì的純度與均一性是關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），直接影響生物制品的安全性、有效性及穩(wěn)定性。尺寸排阻高效液相色譜（SEC-HPLC）以其高分辨率、溫和分離和定量能力，已成為dànbáizhì純度及聚集狀態(tài)分析的核心技術(shù)。本文將介紹SEC-HPLC的原理、操作要點(diǎn)、關(guān)鍵參數(shù)及數(shù)據(jù)解讀方法。

一、SEC-HPLC的原理與優(yōu)勢(shì)

SEC-HPLC（Size Exclusion Chromatography-High Performance Liquid Chromatography）基于分子體積大小進(jìn)行分離。色譜柱內(nèi)填充多孔硅膠或高分子凝膠材料，dànbáizhì分子在流動(dòng)相中通過(guò)“篩分效應(yīng)”進(jìn)入或排除孔隙，分離以分子體積為依據(jù)。大分子因無(wú)法進(jìn)入孔隙而快速洗脫，小分子則被延遲。

主要優(yōu)勢(shì)包括：

• 高分辨率與良好重現(xiàn)性：可區(qū)分蛋白單體、寡聚體及聚集體；

• 溫和分離條件：非變性分離，保持蛋白結(jié)構(gòu)與活性；

• 定量能力突出：紫外吸收等檢測(cè)器可實(shí)現(xiàn)組分定量分析；

• 適用范圍廣：涵蓋單克隆抗體、疫苗、重組蛋白、酶等多種生物制品。

二、樣品制備與系統(tǒng)優(yōu)化

1、樣品準(zhǔn)備

為確保柱效和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，樣品需嚴(yán)格預(yù)處理：

• 使用0.22 µm過(guò)濾器去除顆粒雜質(zhì)，避免堵塞柱床；

• 緩沖液與流動(dòng)相匹配，保持蛋白穩(wěn)定性，避免因緩沖液不同引起基線漂移或峰變形；

• 控制樣品濃度，過(guò)高可能導(dǎo)致柱過(guò)載和峰展寬，過(guò)低則信號(hào)不足。

2、色譜柱與流動(dòng)相

選擇合適孔徑（如300 ?或更高）和粒徑（3–5 µm）的SEC色譜柱，確保分離dànbáizhì單體與聚集體。流動(dòng)相多采用生理鹽濃度（如150 mM NaCl）和中性緩沖液（如磷酸鹽緩沖液），以減少非特異吸附并保持蛋白構(gòu)象。優(yōu)化流速（一般0.2–0.5 mL/min）以兼顧分辨率與分析時(shí)間。

3、系統(tǒng)驗(yàn)證

SEC-HPLC分析前應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)適用性驗(yàn)證，包括：

• 柱效（理論塔板數(shù)）；

• 保留時(shí)間重現(xiàn)性（RSD<1%）；

• 峰面積線性范圍；

• 分子量校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性（不涉及具體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)品牌）。

三、檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

常用檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（UV），檢測(cè)波長(zhǎng)一般為280 nm，適合dànbáizhì芳香族殘基吸收特性。對(duì)于復(fù)雜樣品，可引入多角度光散射（MALS）和示差折光（RI）檢測(cè)，獲取分子量分布與濃度信息。

數(shù)據(jù)解讀關(guān)鍵指標(biāo)包括：

• 純度評(píng)估：主峰面積占總峰面積的百分比，反映蛋白純度；

• 均一性分析：考察單體峰對(duì)稱(chēng)性、半峰寬（FWHM）、保留時(shí)間是否穩(wěn)定；

• 聚集體檢測(cè)：早洗脫峰（大體積）指示高分子聚集體含量；

• 降解產(chǎn)物識(shí)別：晚洗脫峰（小體積）可能指示低分子降解產(chǎn)物；

• 分子量確認(rèn)：利用分子量校準(zhǔn)曲線，推算各組分分子量，結(jié)合MALS檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證均一性。

四、SEC-HPLC在生物制藥中的應(yīng)用價(jià)值

SEC-HPLC在生物藥物開(kāi)發(fā)的多個(gè)環(huán)節(jié)扮演關(guān)鍵角色：

• 藥物研發(fā)：監(jiān)測(cè)重組蛋白、單抗制備過(guò)程中的純度和聚集體含量；

• 工藝開(kāi)發(fā)：優(yōu)化上游表達(dá)與下游純化工藝，確保zuì終產(chǎn)品的質(zhì)量；

• 質(zhì)量控制：作為放行與穩(wěn)定性檢測(cè)的重要手段，評(píng)估批間一致性與長(zhǎng)期穩(wěn)定性；

• 法規(guī)符合性：符合ICH Q6B等國(guó)際質(zhì)量規(guī)范要求，支持注冊(cè)申報(bào)資料。

SEC-HPLC因其溫和、高分辨率及定量能力，已成為dànbáizhì純度與均一性分析的核心技術(shù)。通過(guò)合理的樣品準(zhǔn)備、系統(tǒng)優(yōu)化及數(shù)據(jù)解讀，可全面評(píng)估dànbáizhì量屬性，識(shí)別聚集體及降解產(chǎn)物，確保產(chǎn)品安全與有效性。百泰派克生物科技依托優(yōu)良的SEC-HPLC平臺(tái)與經(jīng)驗(yàn)豐富的分析團(tuán)隊(duì)，提供從方法開(kāi)發(fā)、系統(tǒng)驗(yàn)證到樣品分析的一站式解決方案。我們的服務(wù)涵蓋多種生物藥及復(fù)雜蛋白產(chǎn)品，確保結(jié)果具有高分辨率、良好重現(xiàn)性及可比性，滿足從研發(fā)到生產(chǎn)質(zhì)控的多層次需求。

百泰派克生物科技特色項(xiàng)目

一、蛋白測(cè)序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測(cè)序系統(tǒng)對(duì)dànbáizhì序列進(jìn)行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測(cè)序分析服務(wù)，包括對(duì)dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對(duì)于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測(cè)序法的dànbáizhì從頭測(cè)序服務(wù)，對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.采用目前世界上優(yōu)良的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實(shí)現(xiàn)對(duì)所測(cè)定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測(cè)定蛋白N端多達(dá) 70個(gè)氨基酸序列;

4.可測(cè)定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測(cè);

6.測(cè)序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺(tái)結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學(xué)、bǎxiàngdàn白zhìzǔxué、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù)，助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1 .高通量定量蛋白分析:多對(duì)照組大規(guī)模實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法，適用于分析組織、細(xì)胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測(cè)較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。

三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細(xì)胞原理分離單個(gè)細(xì)胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個(gè)細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子表達(dá)量。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.技術(shù)優(yōu)良，*技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問(wèn)題。可在單細(xì)胞層面上對(duì)多種指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行表征，百泰派克生物科技可做到同時(shí)檢測(cè)51個(gè)目標(biāo)蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個(gè)左右，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級(jí)的提高，且成本不高于單細(xì)胞RNAseq。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會(huì)有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專(zhuān)有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實(shí)現(xiàn)10,000個(gè)以上I型多肽和10,000個(gè)以上II型多肽的鑒定和識(shí)別。通過(guò)我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺(tái)進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析，可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識(shí)別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù)，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù)，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測(cè)平臺(tái)

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測(cè)和項(xiàng)目驗(yàn)證等zhuānyè服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過(guò)CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計(jì)量/期間核查，軟件審計(jì)追蹤，為客戶(hù)提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報(bào)注冊(cè)和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測(cè)分析服務(wù)；

2.獲國(guó)家CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，為客戶(hù)提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測(cè)平臺(tái)，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶(hù)的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

如何使用SEC-HPLC進(jìn)行蛋白質(zhì)純度與均一性分析？檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹