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目的

本應(yīng)用表明Sievers*Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀（BET，Bacterial Endotoxins Testing）所使用的起效光密度（OD，Optical Density）值與96孔微孔板測試所使用的起效光密度值是等效的。Sievers Eclipse微孔板的孔的形狀和光路徑長度不同于96孔板的孔的形狀和光路徑長度，因此需要用比爾定律（Beer’s Law）和吸光度方程來重新計算Sievers Eclipse微孔板的光密度值。證明上述兩種平臺的光密度值的等效性非常重要，這是因為在動態(tài)顯色分析中，起效光密度值用于確定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的起效反應(yīng)時間。

概述

動態(tài)內(nèi)毒素測試依賴于光密度值和內(nèi)毒素濃度變化之間的反比關(guān)系。光密度是“用分光光度計測量的特定波長的有機分子懸浮液或溶液所吸收的光量。”1當(dāng)光通過含有標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）和鱟試劑（LAL，Limulus Amoebocyte Lysate，鱟變形細(xì)胞溶解物）的混合液的光學(xué)孔時，軟件就會報告光密度值的變化。對于動態(tài)分析法來說，起效光密度值是用來確定起效反應(yīng)時間的恒定值。內(nèi)毒素濃度高的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)速度較快，溶液顏色會變黃，使到達(dá)光電二極管的光量較少，因而光密度值較高。起效反應(yīng)時間（即達(dá)到起效光密度所需的時間）越短，樣品中的內(nèi)毒素含量就越高。每次測試完畢后，軟件都會生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示起效反應(yīng)時間（以對數(shù)形式）和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素濃度（以對數(shù)形式）之間的線性關(guān)系。然后將反應(yīng)性樣品和陽性產(chǎn)品對照液（PPC，Positive Product Controls）的起效反應(yīng)時間同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，得出內(nèi)毒素的量化結(jié)果。測得的起效光密度值經(jīng)過優(yōu)化，都被概括在使用說明（IFU，Instructions For Use）中。起效光密度值可以是一個定值，也可以是一系列值。起效光密度也被稱為“閾值光密度”或“反應(yīng)光密度”。

Sievers Eclipse的等效光密度

不同的生產(chǎn)商或供應(yīng)商所提供的96孔板的光路徑長度略有不同。平底96孔板的孔通常是截錐形，使微孔板容易從模具上脫模。我們用幾家主要的微孔板生產(chǎn)商、儀器生產(chǎn)商、LAL供應(yīng)商所提供的數(shù)據(jù)，根據(jù)96個孔中共有200µL溶液來確定光路徑長度，得出的數(shù)值范圍是5.707 mm-6.306 mm。為了將上述范圍縮小到一個定值，位于美國科羅拉多州博爾德市的Sievers分析儀應(yīng)用實驗室重新測量了各種96孔板，得出了光路徑長度范圍的中間值。然后將該值代入以下方程式，就可以將96孔板測試中使用的起效光密度值轉(zhuǎn)換為適用于Eclipse平臺的等效起效光密度值。

用上面的計算公式以及96孔板和Eclipse微孔板的實測路徑長度，算出表1中的光密度值，用于Eclipse軟件。

我們并排測試了96孔板和Eclipse微孔板的光密度值，確認(rèn)這兩種平臺的所有的內(nèi)毒素、PPC、%CV（變異系數(shù)）值都是等效的。如果鱟試劑生產(chǎn)商提供了光密度值范圍，則重新計算整個范圍，然后在Sievers Eclipse平臺上進(jìn)行測試。兩種平臺的所有范圍之間的等效性都得到確認(rèn)，從而證明數(shù)值轉(zhuǎn)換是正確的，生成的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。如果您的實驗室使用各種起效光密度值，建議您進(jìn)行測試，確定哪個值適用于各個樣品，因為當(dāng)測試完畢后，就無法在Sievers Eclipse軟件中更改起效光密度值。表1可以幫助您確定適用于您的樣品的等效光密度值。

結(jié)論

雖然Eclipse BET平臺和96孔微孔板的起效光密度值不同，但我們可以用現(xiàn)成的物理方程式來精確計算出它們的等效值，因此用戶可以放心使用Eclipse平臺測量出來的內(nèi)毒素結(jié)果。如需詳細(xì)的指導(dǎo)，請向您所在地的Sievers業(yè)務(wù)代表或應(yīng)用專家查詢。

參考文獻(xiàn)

1.McCullough,Karen Zink.The Bacterial Endotoxins Test:A Practical Approach.DHI Publishing,LLC,2011.

2.Helmenstine,Anne Marie.Beer’s Law Definition and Equation.ThoughtCo,2019.

• SieversEclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀

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