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技術(shù)文章
原代細(xì)胞核膜的分離
點(diǎn)擊次數(shù)：2434 發(fā)布時(shí)間：2011-1-24
原代細(xì)胞核膜的分離
試劑和器材www.runwelltac.com：
1. DNA酶Ⅰ；
2. KCl（1mol/L溶于20mmol/L Tris-HCl，pH7.4）；
3. MgCl2（1mol/L儲(chǔ)存液）；
4. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（無水乙醇配制的1mol/L儲(chǔ)存液）；
5. 純化的細(xì)胞核；
6. 緩沖液：2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
7. 膜懸浮緩沖液（ESB）：0.25mol/L蔗糖、2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
8. 梯度溶液：1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L的蔗糖溶于2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
9. 除了MgCl2外的所有溶液須含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟；
10. Abbé折光計(jì)；
11. 高速離心機(jī)，配有固定角轉(zhuǎn)子和離心管；
12. 超速離心機(jī)，配有固定角和吊桶式轉(zhuǎn)子、離心管；
13. 相差顯微鏡；
14. 紫外分光光度計(jì)（配石英比色皿）；
實(shí)驗(yàn)方法：
除特殊注明外，所有操作均在0—4℃下進(jìn)行。
1. 將純化的原代細(xì)胞細(xì)胞核浸于緩沖液中孵育10min使之膨大去凝縮。之后約10000g離心10min，用緩沖液重懸沉淀，并重復(fù)這一步驟2次；
2. 用含DNA酶Ⅰ（0.01g/L）的緩沖液重懸凝膠樣溶脹的細(xì)胞核沉淀。充分混勻并室溫孵育30min，孵育的中途將上清調(diào)節(jié)至含約0.1mmol/L MgCl2。隨著DNA被切割裂解，染色質(zhì)很快失去了凝膠狀特性。可通過相差顯微鏡檢測核膜“影子”的產(chǎn)生；
3. 采用固定角轉(zhuǎn)子或吊桶式轉(zhuǎn)子，約60000g離心30min；
4. 用緩沖液重懸核膜粗產(chǎn)物，并再次離心。重復(fù)這一步直至DNA釋放為止（即監(jiān)測上清在280nm下的吸光度，直至達(dá)到一很低平臺(tái)）；
5. 選擇性地用KCl溶液洗滌獲得地核膜，以加速離子結(jié)合蛋白，尤其是組蛋白的去除。然后約60000g離心30min；
6. 將核膜用核膜懸浮緩沖液重懸，覆蓋配制的4個(gè)梯度溶液，置于吊桶式離心機(jī)中離心若干小時(shí)或過夜，以收集核膜等密度層；
7. 純化的核膜應(yīng)該主要聚集在1.5mol/L與1.8mol/L兩蔗糖層的界面，用巴斯德吸管小心地從梯度液中移出核膜層；
8. 通過相差顯微鏡，或者通過瓊脂糖包埋進(jìn)行負(fù)染和/或薄片電鏡，檢查核膜的完整性；
9. 對(duì)純化標(biāo)本進(jìn)行必須的生化分析，如SDS-PAGE或是酶學(xué)實(shí)驗(yàn)；內(nèi)源性過氧化物酶是大鼠肝臟核膜的一個(gè)合適的標(biāo)志，同時(shí)也存在Mg-ATP酶以及很多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶；www.runwelltac.com
除特殊注明外，所有操作均在0—4℃下進(jìn)行。
1. 將純化的原代細(xì)胞細(xì)胞核浸于緩沖液中孵育10min使之膨大去凝縮。之后約10000g離心10min，用緩沖液重懸沉淀，并重復(fù)這一步驟2次；
2. 用含DNA酶Ⅰ（0.01g/L）的緩沖液重懸凝膠樣溶脹的細(xì)胞核沉淀。充分混勻并室溫孵育30min，孵育的中途將上清調(diào)節(jié)至含約0.1mmol/L MgCl2。隨著DNA被切割裂解，染色質(zhì)很快失去了凝膠狀特性。可通過相差顯微鏡檢測核膜“影子”的產(chǎn)生；
3. 采用固定角轉(zhuǎn)子或吊桶式轉(zhuǎn)子，約60000g離心30min；
4. 用緩沖液重懸核膜粗產(chǎn)物，并再次離心。重復(fù)這一步直至DNA釋放為止（即監(jiān)測上清在280nm下的吸光度，直至達(dá)到一很低平臺(tái)）；
5. 選擇性地用KCl溶液洗滌獲得地核膜，以加速離子結(jié)合蛋白，尤其是組蛋白的去除。然后約60000g離心30min；
6. 將核膜用核膜懸浮緩沖液重懸，覆蓋配制的4個(gè)梯度溶液，置于吊桶式離心機(jī)中離心若干小時(shí)或過夜，以收集核膜等密度層；
7. 純化的核膜應(yīng)該主要聚集在1.5mol/L與1.8mol/L兩蔗糖層的界面，用巴斯德吸管小心地從梯度液中移出核膜層；
8. 通過相差顯微鏡，或者通過瓊脂糖包埋進(jìn)行負(fù)染和/或薄片電鏡，檢查核膜的完整性；
9. 對(duì)純化標(biāo)本進(jìn)行必須的生化分析，如SDS-PAGE或是酶學(xué)實(shí)驗(yàn)；內(nèi)源性過氧化物酶是大鼠肝臟核膜的一個(gè)合適的標(biāo)志，同時(shí)也存在Mg-ATP酶以及很多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶；www.runwelltac.com